بررسی هم‌خوانی دو نوع پرایمر rt-pcr جهت تشخیص ویروس آنفلوانزای پرندگان (h9n2)

هدف از انجام این تحقیق استفاده از دو نوع پرایمر rt-pcr برای تشخیص ویروس آنفلوانزای h9n2 پرندگان و مقایسه هم‌خوانی این دو روش نسبت به همدیگر بود تا مشخص شود کدام روش در رقت‌های متوالی تهیه شده دارای آستانه تشخیص بیشتری است. برای این منظور میزان eid50 ویروس آنفلوانزایی که با استفاده از کشت و کیت‌های تجاری مورد تایید قرار گرفته بود، با استفاده از روش reed and muench مشخص شد. تیتر ویروس 10^6  eid50 در میلی‌لیتر بود. از ویروس آنفلوانزای مذکور اقدام به تهیه رقت بر اساس لگاریتم دو شد و با استفاده از کیت rna pure ساخت شرکت سیناژن اقدام به خالص‌سازی ژنوم موجود در نمونه‌های رقیق شد. پس از تهیه cdna برای تشخیص ویروس آنفلوانزا از پرایمرهای منتشر شده در مقالات wu et al. 2008 و spackman et al. 2002 استفاده شد. واکنش‌های rt-pcr برای تشخیص ژن ماتریکس (m) ویروس آنفلوانزای پرندگان بود که هر کدام به ترتیب قطعاتی به اندازه 131 و 100 جفت باز را تشخیص می‌دهند. همچنین برای اطمینان از اختصاصی بودن دو جفت پرایمر مذکور از نمونه ویروس‌های واکسن برونشیت h120 و ویروس واکسن نیوکاسل b1 به عنوان کنترل منفی استفاده شد. هر دو روش نسبت به تشخیص ویروس آنفلوانزا اختصاصی بودند و هیچ کدام از روش‌های مذکور در مورد ویروس برونشیت و نیوکاسل باند تشکیل ندادند. روش  wu et al. 2008 تا رقت 1:4096 و 168 کپی از ژنوم در میلی‌لیتر و روش spackman et al. 2002 تا رقت 1:2048 و 336 کپی از ژنوم در میلی‌لیتر توانستند مشخص کنند. لذا پرایمرهای مربوط به روش  wu et al. 2008 حساس‌تر از روش دیگر می‌باشد.

Correlation between Two RTPCR Primers in Detection of Avian Influenza Viruses (H9N2)

The goal of current study was comparison of two RTPCR primers in detection of H9N2 influenza viruses. We compare correlation between two methods to determine which method in serial dilution can detect more samples. First, EID50 of an avian influenza virus was calculated by ReedMuench method. The titer of virus was 106 EID50/ml. Then, we prepare two fold serial dilution of virus. Then, genome was extracted by RNA Pure kit (CinnaGene, Iran). Two separate one step RTPCR methods were used to detection of avian influenza virus (Wu et al. 2008 and Spackman et al. 2002). Target gene of both methods was matrix (M) gene. Product size that produced by both methods were 131 bp and 100 bp respectively. To ensure about specifity of two RTPCR primers, we used H120 vaccine and B1 vaccine as negative control. Both methods were specific to avian influenza virus and none of them did not produce any amplicons when used other respiratory disease viruses as template. The Wu et al, 2008 primers was able to detect avian influenza virus to 1:4096 and 168 copy number/ml but, Spackman et al, 2000 primers was only able to detect 1:2048 and 336 copy number/ml. So, the Wu et al, 2008 primers was more sensitive method in detection of avian influenza viruses.