جداسازی مایکوباکتریوم ایویوم زیر گونه پاراتوبرکولوزیس از نمونه‌های مشکوک و تائید آن به روش nested-pcr

پاراتوبرکلوزیس (بیماری یون) بیماری مزمن گرانولوماتوزی روده باریک توسط مایکوباکتریوم ایویوم تحت گونه پاراتوبرکولوزیس (map) ایجاد می‌شود. در کنترل بیماری، مهم‌ترین اقدام تشخیص و جداسازی حیوانات آلوده می‌باشد لذا هدف این بررسی جداسازی عامل این بیماری از دام‌های مشکوک و در ادامه تائید جدایه‌ها با استفاده از تست‌های مولکولی بود. برای این منظور 142 نمونه مشکوک ارسالی از استان‌های اصفهان، البرز، تهران، خراسان شمالی، خوزستان، زنجان، فارس، قزوین، کرمان و گلستان پس از آلودگی‌زدایی بر روی محیط کشت هرالد اگ حاوی مایکوباکتین و بدون مایکوباکتین کشت داده شدند. پس از استخراج dna، 16s rrna pcr و سپس از نمونه‌های مثبت nested-pcr انجام شد. در مجموع از 142 نمونه مشکوک 47 جدایه بدست آمد. در گسترش میکروسکوپی همه جدایه‌های مثبت در رنگ‌آمیزی زیل نلسون باسیل اسید فاست مشاهده گردید و در 83 نمونه از مجموع 142 نمونه مورد آزمایش و همچنین از سویه‌های مایکوباکتریایی در جواب 16s rrna pcrباندی در ناحیه bp 543 مشاهده شد که نشاندهنده حضور مایکوباکتریوم در نمونه‌های فوق بود. از تمامی جدایه‌ها و سویه‌های کنترل مثبت و منفی nested-pcr انجام پذیرفت که در مرحله اول باند bp 398 توسط پرایمرهای p90 و p91 و در مرحله بعد قطعه‌ای به طول bp 298 توسط پرایمرهای av1 و av2 حاصل گردید که نشان‌دهنده وجود مایکوباکتریوم پاراتوبرکولوزیس در نمونه‌ها بود. بر اساس این مطالعه nested-pcr به عنوان روش مناسب تشخیص سریع قطعی موارد بیماری پیشنهاد می‌گردد.

Isolation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and confirmation of cases by NestedPCR

Paratuberculosis or Johne’s disease is a chronic granulomatous disease of the small intestine that is caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP).The aim of this study was to determine the status of this disease in suspected animals and finally confirmation of isolates identity by molecular tests. For this purpose, 142 suspicious samples were cultured on plain and mycobactin Jsupplemented Herrold’s eggyolk slants from Isfahan, Alborz, Tehran, North Khorasan, Khuzestan, Zanjan, Fars, Qazvin, Kerman and Golestan provinces. Forty seven isolates were obtained out of 142 suspicious samples. All specimens that were grown on mycobactin Jsupplemented Herrold’s eggyolk slants were detected by ZiehlNeelsen staining as acid Fast bacilia, and in 83 samples of the total, as well as mycobacterial strains, a 543 bp fragment was amplified using PCR16s rRNA. Nested PCR was done on isolates and positive and negative controls. At the first stage, a 398 bp fragment was obtained by P90 and P91 primers, and in the next step, a 298 bp fragment was obtained using AV1 and AV2 primers, which indicates the presence of Mycobacterium paratuberculosis in the samples. Based on this study, NestedPCR is suggested as a suitable rapid diagnostic method for disease cases.