مطالعه تغییرات میزان بیان دو ژن از خانواده ژنی zmpipتحت تنش های محیطی غیرزنده در برگ ذرت (zea mays cv704)

مقدمه گیاهان پیوسته در معرض مجموعه‌ای از عوامل محیطی تنش‌زا قرار می‌گیرند که این عوامل تنش‌زا بسیاری از جنبه‌های ژنتیک و زیست مولکولی گیاه را تحت تاثیر خود قرار می‌دهند. در این بین شوری (nacl ,cacl2)، خشکی از مهمترین عوامل تنش‌زای محیطی به حساب می‌آیند. برای مقابله با این شرایط، گیاه باید قادر به درک، پاسخ‌دهی و سازگاری نسبت به این تغییرات محیطی باشد. مسیر signal transduction و ژن‌های مربوط به آن نقش مهمی در پاسخ به محرک‌های محیطی در گیاهان ایفا می‌کنند. تنش خشکی دامنه‌ای از پاسخ‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی را در گیاهان القاء می‌کند. این پاسخ‌ها شامل بسته شدن روزنه‌ها، مهار رشد سلول، فتوسنتز و فعالیت تنفسی (bartels and sunkars, 2005). از طرفی شوری باعث کاهش میزان کلسیم و پتاسیم و افزایش سطح سدیم و کلر می‌شود. علاوه بر تمام این‌ها, تنش شوری تجمع گونه اکسیژن فعال (ros) را باعث می‌شود که می‌تواند برای غشای لیپیدی، پروتئین‌ها و اسید‌های نوکلوئیک صدمه‌زننده باشد(bartels and sunkars, 2005). برگ‌ها ارگان‌های کلیدی برای تبخیر و فتوسنتز هستند و یک نقش حیاتی در رشد گیاهان ایفا می‌کنند. aqpها پروتئین‌های سرتاسری اصلی هستند که حرکت آب ،co2 و دیگر مواد محلول کوچک را از طریق غشای زیستی تسهیل می‌کنند. بیان آکوآپورین های غشای پلاسمائی (pip ها،پروتئین اصلی غشای پلاسمائی) در بخش های هوائی گونه‌های گیاهی مختلفی گزارش شده است(maurel et al., 2002). طی مطالعات مولکولی در این پژوهش، بیان 2 ژن zmpip شامل zmpip1,2 و zmpip1,5 در برگ ذرت با استفاده از روش بیان ژن، مورد بررسی قرار گرفتند. مواد و روش ها بذرها در خاکی با نسبت معین از پرلیت و ماسه، در فیتتوترون در دمای 22 درجه سانتیگراد و رطوبت 70%، نسبت طول روز به طول شب 8:16 با شرایط کشت یکسان برای همه گیاهان، کاشته شد. پس از گذشت 21 روز از کشت، تیمار گیاهان آغاز گردید. تیمار بطور کوتاه مدت (4 روزه) و بلند مدت (8 روزه) برای سه تنش، شوری nacl(200mm) ، cacl2(40mm) و خشکیpeg6000(10%) اعمال شد. rna کل به روش تریزول از نمونه‌ها استخراج و کیفیت rna از طریق اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد. cdna با استفاده از rna استخراج شده و کیت cdna (fermentas) طبق دستورالعمل شرکت سازنده ساخته شد و سپس rtpcr تحت شرایط شخص اعمال گردید. ژن gapdh به عنوان ژن رفرنس داخلی استفاده شد. محصولات rtpcr روی ژل آگارز 5/1درصد حاوی اتیدیوم بروماید 5/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر جداسازی و با استفاده از سیستم gel logic 212 pro carestream, usa عکس‌برداری شد‌ند. شدت (intensity) باندها با استفاده از نرم افزار image j اندازه‌گیری و نمودارها با استفاده از excel 2007 رسم شد. آنالیز آماری با نرم افزار spss انجام شد. نتایج طبق نتایج به‌دست آمده از آنالیز نیمه کمی rtpcr میزان بیان ژن‌های zmpip1,5 ,zmpip1,2 در برگ گیاهانی که تحت تنش های مختلف قرار گرفتند نسبت به برگ گیاهان شاهد الگوی بیان متفاوتی(کاهش یا افزایش) از خود نشان می‌دهند. نتایج ما نشان داد که ژن‌های خانواده zmpip برای دریافت موثر تغییرات محیطی ضرورت دارد. نتیجه گیری در این پژوهش، مشاهده شد با اعمال تنش روی گیاه الگوی بیان ژن در خانواده zmpip تغییر کرد، در بین تنش‌های اعمال شده با توجه به آنالیز rtpcr و بررسی میزان بیان نسبی ژن‌ها، تنش cacl2(40mm)، و به‌خصوص خشکی peg(10%) دارای اثرات مشخصی در تغییر الگوی بیان ژن‌های بررسی شده داشتند که نشان‌دهنده اثرگذاری این تیمارها بر بیان آن ژن‌ها است. به‌طور کلی افزایش یا کاهش میزان بیان ژن نشان‌دهنده درک تنش توسط گیاه و پاسخ به آن می‌باشد. جالب توجه اینکه حتی الگوی بیان ژن تحت تیمار کوتاه ‌مدت و بلندمدت برای برخی ژن‌ها متفاوت مشاهده شد، این مسئله بیانگر تغییر روند ملکولی در گیاه طی مدت زمان‌‌های متفاوت اعمال تنش بر آن، در پاسخ به تنش هاست.

Abiotic stresses effects on expression of two genes of ZmPIP family in leaves of maize (Zea mays cv 704)

Introduction Plants continuously face several environmental and stressing factors. Among these factors, salinity, drought are the major environmental stimuli that can greatly influence plant growth and productivity. Plant water relations are disturbed by drought or high salinity due to the lowered water potential in the environment hampering water uptake or favouring loss of water from plants. These stresses impose osmotic stress on plants, causing a series of morphological, physiological, biochemical and molecular changes in plants. To survive these stresses, plants have evolved complex mechanisms to perceive external signals and to manifest adaptive responses with proper physiological, morphological and molecular changes (Zhu, 2002). In addition to, Closing of stomata reduces transpirational losses of water from leaves. The uptake and the biosynthesis of compatible solutes and the regulation of membrane permeability and transport are further measures that either hold back water within the plant or facilitate further uptake of water (Zhu, 2001; Sharp et al., 2004). AQPs are present in the tonoplast, the plasma membrane, and possibly in other internal membranes. In addition to water, individual MIP members may mediate the movement of small noncharged molecules, for example glycerol,urea, CO2, or formaldehyde(Tyerman et al., 2002; Gaspar et al., 2003; Uehlein et al., 2003). Furthermore, a role as osmotic or turgor sensors has been suggested for MIPs (Hill et al., 2004). Materials and methods Seeds of maize (Zea mays L. cv. SC. 704) were obtained from Urmia Agriculture Research Centre. Seeds were graded and the big uniform shaped ones selected. Seeds were surface sterilized with 2% sodium hypochlorite for 10 min then washed with sterile distilled water three times. Following vernalization, seeds were placed in growth chamber and transferred to the plastic pot containing a soil mixture of sand (30%) and compost (70%). Plant experienced the following growth conditions for 21 days: the light regime of 16/8 h light/dark with 80% humidity and 22°C temperature. After 21 days of culture, began treatment plants, were applied For short (4 days) and long (8 days) period treatment for three salinity stress NaCl(200mM), CaCl2(40mM) and drought PEG6000(10%). 21 dayoldmaize plants were divided into 8 groups and undergone following treatment for wounding and 4 and 8 days. Results and discussion The RTPCR result of all stressed leaves indicated no significant difference in PEG6000(10%) treatment in comparison to the others treatment. ZmPIP1,2 expression had been increased in NaCl4 , NaCl8, CaCl24 and especially CaCl28 plants compared to control plants. This indication showed the effect of salinity stresses (NaCl and CaCl2) on the ZmPIP1,2 suppression. Semiquantitative RTPCR analysis of ZmPIP1,5 gene expression showed significant reduction in NaCl8 plants while undergoing treatment of plants with CaCl24, PEG4 and PEG8 increase in gene expression observed. Other treated plants did not show significant changes in gene expression. Our results propose these genes are necessary for efficient sensing of environmental changes. Plasma membrane intrinsic proteins belonging to the aquaporin family have been reported to function in water transport in many plant species (Katsuhara et al., 2002; Chaumont et al., 2001; Tester and Bacic, 2005). Conclusions From the results of this experiment, it can be concluded that Semiquantitative RTPCR analysis of ZmPIPs genes expression in maize showed differential response and significant down or up regulation under applied adverse conditions. Further studies must be carried out to investigate the mechanism by which plant gene expression is controlled by abiotic stresses.