ﺟﺪاﺳﺎزی و ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ برخی جدایه‌های باکتریایی و قارچی بر اساس آزمون کیفی فعالیت سلولازی و لیگنینازی از منابع مختلف

سابقه و هدف: برجای ماندن بقایای کشاورزی بویژه ضایعات خشبی و مقاوم به تجزیه و زمان‌بر بودن کمپوست شدن این بقایا، اهمیت استفاده از ریزجانداران تجزیه کننده به عنوان فعال کننده زیستی را نشان می‌دهد. با تلقیح ریزجانداران به بقایای کشاورزی سخت تجزیهشونده، می‌توان سرعت کمپوست شدن آن‌ها را افزایش داد و کمپوستی با کیفیت تولید نمود. هدف از این پژوهش جداسازی، شناسایی و تعیین کارایی انواع باکتری‌ها و قارچ‌های‌ سلولولیتیک و لیگنینولیتیک بود. مواد و روش‌ها: نمونه‌برداری از بافت‌های نیمه پوسیده درختان، مواد آلی شامل کمپوست، ورمی‌کمپوست، کود حیوانی، نمونه‌های جانوری مانند موریانه، کرم خاکی، ماهی آمور و نمونه‌های تجاری حاوی فعال کننده زیستی انجام شد. به منظور جداسازی جدایه‌های باکتری و قارچ با توانایی تولید آنزیم‌های سلولازی و لیگنینازی، بعد از تهیه سری رقت از عصاره‌های هر یک از نمونه‌ها، کشت روی محیط‌های کشت عمومی انجام شد. پس از خالص‌سازی انواع باکتری و قارچ، کارایی از نظر فعالیت سلولازی و لیگنینازی به روش اندازه‌گیری قطر هاله شفاف روی محیط‌های کشت اختصاصی تعیین شد. شناسایی مولکولی جدایه‌های منتخب باکتری و قارچی به ترتیب با تکثیر ناحیه 16s rdna و ناحیه its15.8sits2 انجام شد.یافته‌ها: در مجموع 83 جدایه باکتری و 18 جدایه قارچی با قابلیت تولید سلولاز مشخص گردیدند. جدایه‌های باکتری wb12 و ccb9 به ترتیب با نسبت قطر هاله به قطرکلنی 9.5 و 7.5 بیشترین میزان فعالیت سلولازی را نشان دادند. در جدایه‌های قارچی بیشترین فعالیت سلولولیتیکی مربوط به جدایه‌های wf2 و wf4 بود؛ به‌طوریکه نسبت قطر هاله به قطرکلنی در هر یک از این دو جدایه به ترتیب 4.57 و 2.4 بود. در مورد فعالیت لیگنینولیتیکی مشخص گردید که محیط کشت چاپک حاوی متیل بلو به میزان یک گرم بهترین محیط جهت بررسی فعالیت لیگنینولیتیکی می‌باشد و بیشترین نسبت قطر هاله به قطر کلنی در محیط چاپک به ترتیب در جدایه‌های باکتری wb6 و wb5 و به میزان 10 و 7 مشاهده گردید. در جدایه‌های قارچی فعالیت لیگنینولیتیکی فقط در دو جدایه wf2 و wf4 مشاهده شد؛ به‌طوریکه نسبت قطر هاله به قطر کلنی به ترتیب 2.17 و 2 بود. نتایج شناسایی مولکولی نشان داد که جدایه‌های منتخب باکتری بیشترین تشابه را به bacillus halotolerans، bacillus siamensis، bacillus paralicheniformis، bacillus subtilis، bacillus atrophaeus، bacillus amyloliquefaciens، bacillus circulans، bacillus sp.،citrobacter amalonaticus، serratia marcescens و جدایه‌های منتخب قارچی همانندی بیشتری به گونه‌های penicillium corylophilum و pseudogymnoascus pannorum داشتند. درخت تبارزایی بیشینه صرفه‌جویی با اعتبارسنجی بوت‌استرپ 1000 نشان داد که جدایه‌های باکتری و قارچی به ترتیب در نه و دو کلاد قرار گرفتند.نتیجه‌گیری: بررسی میزان فعالیت سلولولیتیکی نشان داد که باکتری bacillus amyloliquefaciens بیشترین میزان فعالیت سلولولیتیکی را داشت و بیشترین فعالیت لیگنینولیتیکی نیز در باکتری serratia marcescens به‌دست آمد. در جدایه‌های قارچی بیشترین فعالیت سلولولیتیکی و لیگنینولیتیکی در جدایه‌هایpenicillium corylophilum و pseudogymnoascus pannorum مشاهده گردید. بر اساس نتایج این تحقیق، پیشنهاد می‌شود که امکان استفاده از ترکیب ریزجانداران منتخب، جهت تهیه فرمولاسیون‌های اولیه برای تبدیل سریع‌تر ضایعات کشاورزی به کمپوست مورد بررسی قرار بگیرد.

Isolation and identification of some bacterial and fungal isolates based on qualitative test of cellulase and ligninase activity from different sources

AbstractBackground and objectives: The existence of agricultural wastes, especially wood and degradationresistant wastes and timeconsuming composting of these residues, shows the importance of using degrading microorganisms as bioactivators. By inoculating microorganisms into hardtodecompose agricultural residues, it is possible to increase their composting rate and produce quality compost. The aim of this study was to isolate, identify and determine the efficacy of cellulolytic and ligninolytic bacteria and fungi.Materials and methods:Samples were taken from semirotten tissues of trees, organic matter including compost, vermicompost, animal manure, animal samples such as termites, earthworms, amur fish and commercial samples containing bioactivators. In order to isolate bacterial and fungal isolates with the ability to produce cellulose and ligninase enzymes, after preparing a series of dilutions from the extracts of each sample, culture was performed on common culture media. After purification of bacteria and fungi, the efficiency in terms of cellulase and ligninase activity was determined by measuring the diameter of the transparent halo on specific culture media. Molecular identification of selected bacterial and fungal isolates was performed by amplification of 16S rDNA region and ITS15.8SITS2 region, respectively.Results:A total of 83 bacterial isolates and 18 fungal isolates capable of producing cellulase were identified. BB12 and CCB9 isolates showed the highest cellulase activity with a ratio of halo diameter to colony diameter of 9.5 and 7.5, respectively. In fungal isolates, the highest cellulolytic activity was related to WF2 and WF4 isolates; the ratio of halo diameter to colony diameter in each of these two isolates was 4.57 and 2.4, respectively. Regarding ligninolytic activity, it was found that Chapak culture medium containing one gram of methyl blue is the best medium to study ligninolytic activity and the highest ratio of halo diameter to colony diameter in Chapak medium was in WB6 and WB5 bacterial isolates, respectively in the amount of 10 and 7. In fungal isolates, ligninolytic activity was observed only in WF2 and WF4 isolates; So that the ratio of halo diameter to colony diameter was 2.17 and 2, respectively. The results of molecular identification showed that the selected bacterial isolates were most similar to Bacillus halotolerans, Bacillus siamensis, Bacillus paralicheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus atrophaeus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus sercatus, Bacillus sp. The fungi were more similar to Penicillium corylophilum and Pseudogymnoascus pannorum. The maximum parsimony tree with 1000 bootstrap replications showed that bacterial and fungal isolates were located in 9 and 2 clades, respectively.Conclusion: Examination of cellulolytic activity showed that Bacillus amyloliquefaciens showed the highest amount of cellulolytic activity and the highest ligninolytic activity was seen in Serratia marcescens. In fungal isolates, the highest cellulolytic and ligninolytic activities were observed in Penicillium corylophilum and Pseudogymnoascus pannorum. Based on the results of this study, further investigation is suggested about the possibility of using a combination of selected microorganisms to prepare initial formulations for faster conversion of agricultural waste into compost.