ارزیابی توان مهارکنندگی اروینیا کاراتوورا توسط باکتری های ریزوسفر و اندوفیت

سابقه و هدف: باکتری erwinia carotovora پاتوژن بسیاری از گونه‌های مهم گیاهی بوده و شمار فراوانی از گیاهان زینتی و کشاورزی مانند ذرت، برنج، گوجه فرنگی، پیاز، چغندرقند و نیز سبزی‏ها را آلوده می‌کند. این باکتری یکی از مهمترین عواملی است که با پیدایش پوسیدگی نرم در ساقه و غده سیب‌زمینی پیش و پس از برداشت تا اندازه فراوانی بازدهی گیاهان را کاهش می‌دهد. اگرچه این بیماری در بیشتر مناطق سیب‌زمینی‌کاری کشور گزارش شده است اما هنوز یک اقدام مهاری سازگار با محیط زیست برای پیشگیری از این بیماری انجام نشده است. بنابراین شناسایی عوامل زیستی کارا در مهار بیماری پوسیدگی نرم به ویژه در قطب‌های کشاورزی کشور مانند استان گلستان امری ضروری به نظر می‌رسد. بنابراین هدف از انجام این پژوهش جداسازی و شناسایی باکتریهای ریزوسفر و اندوفیت با کارکرد آنتاگونیستی دربرابر e. carotovora در کشتزارهای سیب زمینی روستاهای مرزنکلا و فاضل آباد شهرستان گرگان واقع در استان گلستان بود. مواد و روش‌ها: نمونه های خاک، ریشه، برگ و ساقه سیب زمینی روی محیط نوترینت آگار کشت داده شده و پس از گرماگذاری پرگنه‌های رشدکرده از نظر ریخت شناسی بررسی شدند. پس از ناب‌سازی پرگنه‌ها، در آغاز شناسایی جدایه‌ها با انجام رنگ‌آمیزی گرم و بررسی توانایی ساخت اسپور انجام شد. کارکرد آنتاگونیستی جدایه ها به روش پخش از چاهک در آگار بررسی شد. در این روش پلیت‌ها در دمای اتاق برای 3 تا 5 روز گرماگذاری شده و هاله نبود رشد در پیرامون چاهک‌ها اندازه‌گیری شد. برای بررسی ساخت ماده‌ پادزیست در جدایه های آنتاگونیست از آزمون کلروفورم بهره‌گیری شد. برای شناخت سرشت و زاد ماده‌ پادزیست از آزمون های کاتالاز و حساسیت به پروتئازها بهره‌گیری گردید. سپس پایداری گرمایی ماده‌ پادزیست و اثر ph روی کارکرد مهارکنندگی آن سنجیده شد. جدایه های با کارکرد آنتاگونیستی بیشتر بر پایه تعیین توالی ژن 16s rrna شناسایی شدند. یافته‌ها: سرهم 42 سویه‌ باکتریایی به ترتیب از ریشه (13)، برگ (7) ساقه (5) و خاک ریزوسفر (17) جدا شد. در میان جدایه‌ها، 33 جدایه گرم مثبت و 9 جدایه گرم منفی بودند. بر پایه نتایج به دست آمده از بررسی کارکرد آنتاگونیستی جدایه‌ها، 8 جدایه دربرابر e. carotovoraکارکرد آنتاگونیستی از خود نشان دادند که همگی باسیل گرم مثبت اسپوردار بوده و جنس باسیلوس بودند. کارکرد مهاری جدایه‌ها با یافته های به دست آمده از آزمون کلروفورم همخوانی داشت. در برابر گواه آزمایش، جدایه‌ با هاله‌ نبود رشد بزرگتر، ماده‌ پادزیست بیشتری ساخت. در آزمون کاتالاز آشکار گردید که سرشت ماده‌ پادزیست ساخته شده در جدایه‌ها پراکسیدئیدروژن ندارد. آن‏ها پس از تیمار با پروتئازها ناکارا شدند که نشان می‌‌‌دهد، سرشت آنها پروتئینی است. توان پادزیستی و مهارکنندگی آبگونه رویی کشتگاه این جدایه ها در دمای 100 درجه سانتی‌گراد از میان رفت و بهترین نشان مهارکنندگی را در ph 7 تا 8 داشتند. جدایه‌هایی که بیشترین کارکرد مهاری را دربرابر e. carotovoraداشتند، بر پایه توالی ژن16s rrna شناسایی شدند. پس از بررسی توالی نوکلوتیدی آن ژن آشکار شد که این جدایه‌ها به ترتیب بیش از 90 درصد به bacillus subtilis سویه zwq-1 و bacillus mycoides سویه 29b-b9 همانندی دارند.نتیجه‌گیری: از آنجایی که در این پژوهش جدایه‌های دارای بهترین نشان مهارکنندگی دربرابر e. carotovora از جنس bacillus بودند، شاید بتوان از توان بازدارندگی این باکتری‌ها برای مهار زیستی بیماری‌های گیاهی بهره گیری کرد، وانکه برای داوری بهتر در باره کارکرد آن‌ها انجام آزمایش‌‌های بیشتر در گلخانه و کشتزارها پیشنهاد می‌گردد.

Evaluation of inhibitory potential of rhizosphere and endophytic bacteria against Erwinia carotovora

Background and objectives: Erwinia carotovora is a pathogen of many important plant species and infects a large number of ornamental and agricultural plants such as corn, rice, tomatoes, onions, sugar beets and vegetables. This bacterium is one of the most important factors that greatly reduces crop yields by causing soft rot in the stems and tubers of potatoes before and after harvest. Although the disease has been reported in most potatogrowing areas of the country, no environmentally friendly control measure has been taken to prevent this disease. Therefore, identifying the biological factors effective in controlling soft rot disease, especially in agricultural hotspots such as Golestan province, seems to be essential. This study aimed to isolate and identify rhizosphere and endophytic bacteria with antagonistic activity against E. carotovora in potato fields of Marzankola and Fazelabad villages of Gorgan city located in Golestan province.Materials and methods: Soil, root, leaf and stem samples of potatoes were cultured on nutrient agar medium and after incubating at 26°C for 3 5 days the grown colonies were morphologically examined. After purification of the colonies, the initial identification of the isolates was performed by Gram staining and the ability to produce spores. The antagonistic activity of the isolates was determined by agar well diffusion method. In this method, the plates were incubated at room temperature for 35 days and the growth inhibition zone was measured around the wells. Chloroform test was used to evaluate the production of antimicrobial agent by antagonist isolates. Catalase and protease sensitivity tests were used to determine the nature of the antimicrobial agent. Then, the thermal stability of the antimicrobial agent and the effect of pH on its inhibitory activity were measured. Isolates with more antagonistic activity were identified based on 16S rRNA sequencing.Results: A total of 42 bacterial strains were isolated from roots (13), leaves (7), stems (5) and rhizosphere soil (17). Among the isolates, 33 isolates were Grampositive and 9 isolates were Gramnegative. Based on the results of antagonistic activity of isolates, the 8 isolates showed antagonistic activity against E. carotovora, all of which were Grampositive sporeforming bacilli and belonged to the genus Bacillus. The inhibitory activity of the isolates was consistent with the results obtained from the chloroform test. That is, compared to the control, the isolate with a greater amount of antimicrobial agent had the larger growth inhibition zone. In the catalase test, it was found that the antimicrobial substance produced by the isolates is of a nature other than hydrogen peroxide and it was inactivated after treatment with proteases, indicating their protein nature. The inhibitory activity of the supernatant of these isolates was lost at 100 ° C and had the best inhibitory effect at pH 7 to 8. The isolates that had the highest inhibitory activity against E. carotovora were identified based on the sequence of 16 S rRNA gene. After sequencing, these isolates were found to be more than 90% similar to Bacillus subtilis strain ZWQ1 and Bacillus Mycoides strain 29BB9, respectively.Conclusion: Considering that in the present study, the isolates with the best inhibitory effect against E. carotovora belonged to the genus Bacillus, it seems that the antagonistic potential of these bacteria can be used for biological control of plant diseases, of course, to better judge about their performance, it is necessary to conduct further experiments in greenhouse and field conditions.