جداسازی مولکولی ژن srf از باسیلوس‌های خاک‌زی گرمادوست و کلونینگ آن در سلول مستعد به‌منظور استفاده در صنعت

زمینه و هدف: باسیلوس‌های ترموفیل، حامل ژن‌های مختلف و بیوسورفکتانت‌ها می‌باشد. سورفکتانت‌های میکروبی مولکول‌های فعال سطحی هستند که توسط انواع میکروارگانیسم‌ها از جمله باکتری‌ها، مخمرها و قارچ‌های رشته‌ای تولید می‌شوند. بیوسورفکتانت‌ها قادر به کاهش انرژی سطحی بین فازها و ایجاد موانع الکترواستاتیکی هستند و در نتیجه از ادغام ذرات جلوگیری می‌کنند. هدف از مطالعه‌ی حاضر، جداسازی مولکولی ژن  srf از باسیلوس‌های خاک‌زی گرمادوست و کلونینگ آن در سلول مستعد به‌منظور استفاده درصنعت است.روش بررسی: 15 نمونه خاک مناطق مختلف کرمان جمع‌آوری و به‌منظور جداسازی سویه‌های باسیلوس غربال شدند. مطالعات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی جهت شناسایی سویه‌ها انجام شد. پس از بررسی بیوشیمیایی جدایه‌های میکروبی جداسازی شده و تایید سویه‌های باسیلوس، استخراج dna صورت گرفت. سپس با روش pcr ژن  srf از این جدایه‌ها شناسایی گردید. قطعه تکثیر یافته توسط روش ta کلونینگ به داخل وکتور ptg19 وارد شد. سپس وکتور نوترکیب به باکتری e.coli سویه اوریگامی ترانسفورم و با استفاده از روش‌های رایج تایید کلونینگ صورت گرفت. ژن خانگی 16s rrna به‌عنوان کنترل داخلی تست استفاده شد. بررسی میزان بیان ژن با اندازه‌گیری نسبی بیان mrna در مقایسه با کنترل منفی که باکتری e.coli فاقد ژن srf بود، انجام شد.یافته‌ها: درمجموع، 12 جدایه باسیلوس‌های ترموفیل از نمونه‌های خاک به دست آمد. در نتیجه‌ی واکنش pcr برای ژن  srf با پرایمرهای طراحی شده 1 جدایه(8/3%) مثبت رویت شد. حضور ژن  srf و بیان این ژن توسط آزمون real time pcr بررسی شد. بررسی کلنی‌های سفید و آبی، پرایمر m13، محل اتصال و تعیین توالی ژن 16s rrna تاییدکننده‌ی صحت کلونینگ ژن مذکور در باکتری میزبان بود.نتیجه‌گیری: مطالعه‌ی حاضر، موفق به شناسایی باسیلوس گرمادوست بومی حامل ژن  srf بود که جهت دستیابی گسترده، راحت و مقرون به‌صرفه به آنزیم بیوسورفکتانت، جهت استفاده در مصارف صنعتی، کشاورزی، حذف آلاینده‌های نفتی و کاهش کشش سطحی محیطی می‌باشد که می‌توان از آن در صنایع مذکور بهره برد. 

the molecular isolation of the srf gene from thermophilic soil bacilli and its cloning in susceptible cells for industry use

background and aim: thermophilic bacillus is a type of thermophilic bacillus, carries various genes and biosurfactants, microbial surfactants are surface active molecules produced by various microorganisms such as bacteria, yeasts and filamentous fungi. biosurfactants are able to reduce the surface energy between phases and create electrostatic barriers, thus preventing the integration of particles. the aim of the present study was the molecular isolation of the srf  gene from thermophilic soil bacilli and its cloning in susceptible cells for industry use.materials and methods: fifteen samples from different regions of kerman were collected and screened to isolate bacillus strains. morphological and biochemical studies were done to identify the strains. after biochemical examination of isolated microbial isolates and confirmation of bacillus strains, dna extraction was done. then, the srf  gene was identified by pcr method from these isolates. the amplified fragment was inserted into ptg19 vector by ta cloning method. then, the recombinant vector was transformed into e.coli origami bacteria and cloning was confirmed using common methods. the housekeeping gene 16s rrna was used as the internal control of the test. the analysis of the gene expression level was performed by measuring the relative expression of mrna as compared to the negative control that e.coli bacteria lacked the srf gene.results:  a total of 12 isolates of thermophilic bacilli were obtained from soil samples. as result, the pcr reaction for the srf  gene with the designed primers was found to be positive in 1 isolate (8.3%). the presence of srf  gene and the expression of this gene were checked by real time pcr test. examining the white and blue colonies, m13 primer, junction location and determination of the 16s rrna gene sequence confirmed the correctness of the cloning of the mentioned gene in the host bacteria.conclusion: as a result of the present study, it was possible to identify the native thermophilic bacillus carrying the srf gene, which can be used to obtain biosurfactant enzyme widely, conveniently and economically, for use in industrial and agricultural purposes, removing oil pollutants and reducing environmental surface tension, etc. which can be advantages.