همسانه‌سازی، بیش بیان و بررسی خصوصیات آنزیم قلیایی فیتاز (phyC) در باکتری اشرشیا کلی

چکیدهفیتاز (مایواینوزیتول هگزا کیس فسفات فسفو هیدرولاز) آنزیمی هیدرولیزی است که فسفات معدنی تولید می‌کند. ژن کد کننده فیتاز phyc از باکتری باسیلوس سابتیلیس atcc12711 جداسازی و توالی یابی شد. توالی نوکلوتیدی ژن فیتاز حاوی ناحیه کدکننده به طول 1089 جفت باز است که 90 نوکلوتید ابتدایی آن، مربوط به سیگنال پپتید ژن می‌باشد. به منظور تولید آنزیم فیتاز نوترکیب، ژن هدف به وکتور بیانی pet32a (+) وارد شد و وکتور نوترکیب پس از تکثیر در باکتری اشرشیا کلی dh5? به باکتری اشرشیا کلی bl21(de3) به عنوان میزبان بیان منتقل شد. تحریک بیان ژن با استفاده از iptg در غلظت نهایی 1 میلی مولار در دمای 30 درجه سانتی گراد و حضور کلرید کلسیم 10 میلی مولار صورت گرفت. نمونه‌گیری در زمان‌های صفر تا پنج ساعت انجام شد و میزان تولید پروتیین نوترکیب با استفاده از الکتروفورز بررسی گردید. فیتاز محلول حاصل از ژن phyc-trx با موفقیت به شکل درون‌سلولی در باکتری اشرشیا کلی بیان شد. وزن مولکولی فیتاز نوترکیب تولید شده در حدود 64 کیلو دالتون تخمین زده شد. اندازه گیری فعالیت آنزیمی با استفاده از روش استاندارد فسفاتاز، فعالیت آنزیم نوترکیب تولید شده را 44/7 واحد در میلی‌لیتر نشان داد. همچنین ph بهینه برای فعالیت آنزیم فیتاز قلیایی نوترکیب در حدود 7 برآورد شد. نتایج نشان داد که فیتاز بدست آمده از باکتری باسیلوس سابتیلیس به جهت پایداری حرارتی و همچنین هزینه پایین تولیدی گزینه مطلوبی جهت استفاده در صنعت می‌باشد.