طراحی سازه ژنی فیتاز ایکولای و فیتاز آسپرژیلوس نایجر و بیان آن در مخمر پیکیا پاستوریس به‌منظور افزایش تجزیه فیتات گیاهی

هدف: فیتازها براساس اولین کربنی که در حلقه میواینوزیتول فسفات در فیتات دفسفریلاسیون شروع می شود به گروه های 3 فیتازها (e.c. 3.1.3.8) ، 6 فیتازها (e.c. 3.1.3.26) و 5 فیتازها (ec 3.1.3.72) طبقه بندی می شوند مخمرها با داشتن ویژگی های زیادی ازجمله دستکاری ژنتیکی آسان، بیان بالای پروتئین های برون سلولی و درون سلولی و توانایی انجام اصلاحات پس ازترجمه ای متناسب با سلول های یوکاریوتی، برای بیان پروتئین های خارجی مناسب هستند. مخمر متانول دوست پیکیا پاستوریس برای تولید پروتئین های نوترکیب در تراکم سلولی بالا و محیط کشت ارزان، توسعه یافته است. بنابراین بیان همزمان دو آنزیم دریک میزبان بیانی نوترکیب سودمند خواهد بود. هدف ازاین مطالعه ساخت وکتور نوترکیب حاوی ژن های فیتاز ایکولای از خانواده 6 فیتاز و فیتاز آسپرژیلوس نایجر از خانواده 3 فیتاز به منظور افزایش تجزیه فیتات و بیان همزمان آنها در مخمر پیکیا پاستوریس بود.روش: توالی نوکلئوتیدی ژن های آنزیم فیتاز ایکولای ، (appa2) فیتاز آسپرژیلوس نایجر ، (phya) لینکر 2a و سیگنال پپتید آلفا فاکتور از پایگاه داده ncbi دریافت گردید. در این پژوهش ژن های فیتاز ایکولای و آسپرژیلوس نایجر که بوسیله لینکر 2a بهم متصل شده بودند در پلاسمید pic9k طراحی و برای سنتز به شرکت genescript آمریکا فرستاده شد. پس از دریافت پلاسمید سنتز شده که حاوی ژن های مورد نظر بود این سازه ژنی در باکتری dh5a کلون شد و پس از برش با آنزیم saci در مخمر پیکیا پاستوریس الکتروترنسفرم شد. تحریک بیان ژن با استفاده از متانول در غلظت نهایی نیم درصد در دمای 30 درجه سانتیگراد صورت گرفت. نمونه‌گیری هر24 ساعت انجام شد و میزان تولید پروتئین نوترکیب بااستفاده از الکتروفورز بررسی گردید. یافته ها: نتایج حاصل از کلونی pcr نشان داد که وکتور مورد نظر با موفقیت در باکتری dh5a ترانسفرم شده است و نتایج حاصل از pcr نشان داد که پلاسمید با موفقیت وارد مخمر شده است. فیتازappa و فیتاز phya با موفقیت در مخمر پیکیا پاستوریس بیان شد. وزن مولکولی فیتازهای نوترکیب تولید شده در حدود 45 و 80 کیلو دالتون به ترتیب برای فیتاز appa و فیتاز phya تخمین زده شد. فعالیت آنزیم نوترکیب تولید شدهu/ml 160.97 بود.نتیجه گیری: به منظور تولید مکمل آنزیم فیتاز نوترکیب، ژن های هدف دروکتور بیانی ppic9k طراحی و سنتز شد و وکتور نوترکیب پس از تکثیر در باکتری اشرشیا کلیdh5α وارد ژنوم مخمر پیکیا پاستوریس به عنوان میزبان بیانی شد. این سازه ژنی برای انجام آزمایشات بعدی (آزمایشات مزرعه ای) استفاده خواهد شد.

design of gene structure and expression of e. coli phytase and aspergillus niger phytase in pichia pastoris yeast in order to increase plant phytate degradation.

phytases are classified as 3 phytases (e.c.3.1.3.8), 5 phytases (e.c. 3.1.3.72) and 6 phytases (e.c. 3.1.3.26) based on the position of the first phosphate residue removed from the myo inositol ring of phytate. yeasts are particularly suited to expression of foreign proteins for numerous features mean while some of them shows probiotic properties. pichia pastoris, has been developed for the production of various recombinant proteins and growth into high cell densities in an inexpensive medium. accordingly, pichia pastoris is an appropriate secretory system for obtaining larger quantities of correct products, in compared to other host cells. the coexpression of digestive enzymes in a single recombinant cell system would thus be advantageous. the objective of this study is to determine whether combining fungal phytases (3 phytase) with bacterial phytase (6 phytase) was more effective than each phytase alone in degrading of plant phytate. we tested the new vector, aimed to clone and coexpress the phytase genes isolated from e. coli and aspergillus niger and transformed into pichia pastoris. evaluations were made for the biochemical properties of the active expressed phytase. methods: the nucleotide sequence of phya and appa2, 2a peptide and alpha factor were obtained from ncbi database. a coexpression system for the extracellular production of phytase of aspergillus niger (3 phytase) and phytase of e. coli (6 phytase) will be established in pichia pastoris yeast. plasmid that used in this study was ppic9k. the genes for each enzyme are fused in frame with the “a factor” secretion signal and linked by the 2a peptide encoding sequence. after receiving the synthetic plasmid with fragments, plasmid that contained phya and appa2 was cloned in dh5@ and after that digested by saci and electrotransfered into pichia pastoris. positive cells are resuspended at bmmy containing methanol as an inducer. to follow the induction, methanol was injected into the culture every 24 hours in order to reach a definitive concentration of 0.5 percent. the recombinant protein was analyzed using sds page.result: the results showed that the recombinant phytase gene was transferred to pichia pastoris and the results of pcr confirmed that. the molecular weight of the produced recombinant phytases was estimated to be around 45 and 80 kda for appa and phya, respectively. the recombinant protein has phytase activity equal to 160.97 u/mlconclusions;the designed phytase genes containing phya and appa were successfully cloned in dh5a and the recombinant plasmid was transferred to pichia pastoris for high expression. recombinant yeast will be used for further experiments.