جداسازی، شناسایی و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های فسفولیپاز a2 و هیالورونیداز زهر زنبور عسل ایرانی mellifera meda) (apis

هدف: زهر زنبور عسل حاوی آنزیم هایی مختلفی نظیر هیالورونیداز و فسفولیپاز a2 است که بعضی از آنها کاربرد دارویی و پزشکی دارند. در تحقیقات متعددی، فعالیت فسفولیپاز a2 و هیالورونیداز در گونه های مختلف زنبور عسل گزارش شده است اما گزارشی در مورد این آنزیم‌ها و چگونگی فعالیت آنها در زهز زنبور عسل ایرانی وجود ندارد. لذا هدف از این تحقیق جداسازی، شناسایی آنزیم‌های فسفولیپاز a2 و هیالورونیداز و اندازه‌گیری میزان فعالیت آنها در زهر خام و اجزای زهر زنبور عسل ایرانی (apis mellifera meda) بود.  مواد و روش ها: ابتدا 100 میلی‌گرم زهر خام زنبور عسل با کمک کروماتوگرافی سفادکس g-50 در بافر استات آمونیوم 05/0 میلی مولار خالص‌سازی شد. جهت بررسی پروفایل پروتئینی زهر و  جزءبندی از روش الکتروفورز عمودی استفاده گردید. سپس مقدار پروتئین، فعالیت آنزیم فسفولیپاز a2 و هیالورونیداز در زهر خام و فراکسیو ن‌های جدا شده اندازه‌گیری شد. مقدار پروتئین در زهر خام عسل ایرانی و اجزای آن با استفاده از پروتئین سنجی بروش برادفورد تعیین گردید. میزان فعالیت آنزیم فسفولیپاز a2  با استفاده از سوسپانسیون زرده تخم مرغ به عنوان سوبسترا تعیین شد و میزان فعالیت هیالورونیداز روی هیالورونیک اسید به روش توربیدومتری آزمایش شد. نتایج: نتایج اولیه نشان داد که 56 درصد زهر خام پروتئین بوده است. زهر خام به 3 پیک (جزء) مجزا شد. فعالیت فسفولیپاز a2 در زهر خام و پیک اول و دوم مشاهد شد. فراکسیون دوم بیشترین فعالیت فسفولیپازی را نشان داد. فعالیت هیالورونیدازی در زهرخام و تنها در پیک اول مشاهده شد. فعالیت بهینه آنزیم فسفولیپاز a2 در ph برابر 7 و دمای 37درجه سانتیگراد بدست آمد. در این مطالعه مشخص شد که فعالیت هیالورونیداز در زهر زنبور عسل ایران بیشترین فعالیت را در دمای 37 تا 39 درجه دارد و با افزایش درجۀ حرارت به تدریج فعالیت خود را از دست می‌دهد. همچنین نتایج این مطالعه نشان داد که ph ایده‌آل برای فعالیت آنزیم هیالورونیداز 5/5 می‌باشد.نتیجه گیری: زهر زنبور عسل ایرانی دارای هر دو فعالیت فسفولیپازی و هیالورونیدازی می‌باشد که با استفاده از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون می‌توان آنها را جدا کرد. این بررسی می‌تواند به عنوان روشی برای جداسازی، تخلیص و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های هیالورونیداز و فسفولیپاز a2 زهر زنبور عسل ایرانی معرفی شود. آنزیم‌های هیالورونیداز و فسفولیپاز a2 خالص‌ سازی شده می‌توانند جهت استفاده در صنعت و تحقیقات مورد استفاده قرار گیرند.

isolation, characterization, and biological activity of phospholipase a2 (pla2) and hyaluronidase from iranian honey bee venom (apis mellifera meda)

bee venom contains various enzymes such as hyaluronidase and phospholipase a2, which have medical and pharmaceutical applications. in several studies, the activity of phospholipase a2 and hyaluronidase has been reported in different bee species, but there is no report about these enzymes and their activities in iranian honey bee venom. therefore, the purpose of this research was to isolate, identify phospholipase a2 and hyaluronidase enzymes and measure their activity in crude venom and its fractions of iranian honey bee (apis mellifera meda).materials and methodsone hundred mg of the crude venom was purified using gel filtration chromatography on sephadex g-50, equilibrated with 0.05mm ammonium acetate buffer. sds-page was used to determine the protein profile of bv and its fractions. protein concentration, phospholipase a2 and hyaluronidase enzyme activity of apis mellifera crude venom and its fractions were measured. protein concentration of apis mellifera crude venom and its fractions was determined using bradford method. phospholipase a2 (pla2) activity was determined using suspension of egg yolk as substrate. the activity of hyaluronidase was determined turbidimetrically.resultsthe preliminary results showed that the 56% of crude venom was protein. crude venom produced three fractions. phospholipase a2 activity was observed in the crude venom as well as in the first and second fractions. the second fraction showed the highest phospholipase activity. hyaluronidase activity was observed in crude venom and only in the first fraction. the optimal activity of bee venome phospholipase a2 enzyme was obtained at ph 7 and 37 °c. in this study, it was found that the activity of hyaluronidase in iranian honey bee venom has the highest activity at 37 to 39 °c and gradually loses its activity as the temperature increases. also, the results of this study indicate that the optimum ph for hyaluronidase enzyme activity is 5.5.conclusionsiranian honey bee venom has both phospholipase and hyaluronidase activities, which can be separated using gel filtration chromatography. this study can be introduced as a simple method to isolate, purify and measure the activity of hyaluronidase and phospholipase a2 enzymes of iranian honey bee venom. purified hyaluronidase and phospholipase a2 enzymes can be used in industry and research.