همسانه سازی، و بررسی بیان ژن mannose-6-phosphate reductase (m6pr) گیاه کرفس در باکتری اشرشیاکلی جهت کنترل مسیر کاتابولیسم

هدف: اطلاعات کمی در مورد متابولیسم قند و نحوه ادغام آن با سایر مواد، در مقایسه با سایر محصولات فتوسنتزی اولیه (مانند ساکارز و نشاسته) وجود دارد. mannose-6-phosphate reductase (m6pr) یک آنزیم کلیدی است که در بیوسنتز مانیتول در کرفس نقش دارد. هدف از این پژوهش  همسانه سازی ژن، بررسی بیان ژن و تخلیص آنزیمm6pr  و بررسی عملکرد آن بر روی ژن های جهش یافته در محیط آزمایشگاهی بوده است.مواد و روش‌ها: ابتدا  استخراج mrna از گیاه کرفس انجام شدو سپس سنتز cdna صورت گرفت و محصول به عنوان الگو در تکثیر ژن m6pr  مورد استفاده قرار گرفت..محصول pcr توسط کیت استخراج dna از روی ژل، تخلیص شد. محصول pcr خالص شده مطابق با دستور العمل t/a cloning (فرمنتاز) در ناقل ptz57r همسانه سازی شد. سلول مستعد e.coli سویه top10 با استفاده از روش بیوشیمیایی کلرید کلسیم تهیه شد و وکتور نوترکیب درون آن ترانسفورم و روی پلیت حاوی آمپی سیلین کشت داده شدند. صحت کلونینگ با استفاده از pcr ژن m6pr  و هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب توسط آنزیم های bamhi, saci (شرکت فرمنتاز) انجام گرفت.  سپسژن m6pr  در پلاسمید بیانی pet32a  همسانه سازی شد و درون باکتری e.coli سویه bl2i انتقال داده شد. پیشبر ژن با iptg القا شد و با وسترن بلاتینگ مورد بررسی قرار گرفت.  پروتئین تولید شده با ستون کروماتوگرافی تمایلی (his.tag/s.tag) تخلیص شد.نتایج: نتایج نشان دادند که آنزیم می تواند نواحی هترودوبلکس ژن را شناسایی کند. m6pr  نوترکیب خالص شده از اشریشیا کلی،دارای فعالیت خاص مولکولی بود. نتایج حاصل از هضم دوگانه پلاسمید با آنزیم های saci و bamhi، قطعات 2870 جفت بازی و 186 جفت بازی بود. قطعه حاضر مطابق با نتیجه ازمون بلاست شباهت 100درصدی با ژن m6pr گیاه کرفس داشت. نتایج بررسی رونویسی ژن نوترکیب m6pr نشان داد که میزان رونویسی ژن نوترکیب m6pr در سویه های تراریخت برابر با 3/2 و در کنترل 32/0 به دست آمد که تفاوت معناداری در سطح p<0.01 را از نظر آماری نشان دادند. پس از القای پیشبر و نمونه برداری در زمان های مختلف، نمونه ها روی ژل sds-page باند پروتئینی در ناحیه 42 کیلو دالتون را نشان داد که نشان دهنده بیان پروتئین به صورت موفقیت آمیز بود.نتیجه‌گیری:  همسانه سازی ژن آنزیمm6pr  بدست آمده از گیاه کرفس و به دنبال آن تولید این آنزیم به صورت نوترکیب در آزمایشگاه می تواند منجر به بیان بالای  آن در سیستم پروکاریوتی  شود به طوریکه آنزیم دارای فعالیت  باشد. همچنین مطالعه حاضر نشان داد که آنزیم های گیاهی وقتی در باکتری بیان می شوند، فعال می باشند و می توانند به عنوان منبع مناسب برای تسریع فعالیت کاتابولیک استفاده شوند.

cloning and investigation of celery plant mannose-6-phosphate reductase (m6pr) gene expression in e. coli bacteria to control the catabolism pathway

compared to other primary photosynthetic products (such as sucrose and starch), little is known about sugar metabolism and how it is integrated with others. mannose-6-phosphate reductase (m6pr) is a key enzyme involved in mannitol biosynthesis in celery. this study aimed to clone the gene, express and purify the m6pr enzyme and investigate its function on mutated genes in a laboratory environment. materials and methodsfirst, the mrna was extracted from the celery plant, then the cdna was synthesized, and the product was used as a template to amplify the m6pr gene. the pcr product was purified in a dna gel extraction kit. the purified pcr product was cloned into the ptz57r vector according to the t/a cloning recipe (fermentase company). susceptible cells of e.coli strain top10 were prepared using the biochemical method of calcium chloride, and the recombinant vector inside it was transformed and cultured on a plate containing ampicillin. the cloning accuracy was done using m6pr gene pcr and enzymatic digestion of the recombinant plasmid by bamhi and saci enzymes (fermentase company). the m6pr gene was homogenized in the expression plasmid pet32a and transferred into e.coli strain bl2i. the promoter was induced with iptg and analyzed by western blotting. the protein was purified by affinity chromatography column (his. tag/s.tag).resultsthe results showed that the enzyme could identify the heteroduplex regions of the gene. the recombinant m6pr purified from escherichia coli had specific molecular activity. the results of double digestion of the plasmid with saci and bamhi enzymes were 2870 bp and 186 bp fragments. according to the blast test result, the current fragment had 100% similarity with the m6pr gene of the celery plant. m6pr recombinant gene transcription results showed that the m6pr recombinant gene transcription rate was 2.3 in the transgenic strains and 0.32 in control, which showed a statistically significant difference at the p<0.01 level. after induction of the promoter and sampling at different times, the samples on the sds-page gel showed a protein band in the region of 42 kda, indicating the protein’s successful expression. conclusionshomology of m6pr enzyme gene obtained from celery plant and then recombinant production of this enzyme in the laboratory can lead to its high expression in the prokaryotic system so that the enzyme has activity. also, the present study showed that plant enzymes are active when expressed in bacteria and can be used as a suitable source to accelerate catabolic activity.