امکان سنجی پالایش ژنتیکی صفت دوقلوزایی در گوسفندان با هدف کاهش تقلبات احتمالی- یک مطالعه‌ی استانی

هدف: اخیراً، در استان آذربایجان شرقی، حین خرید و فروش قوچ متعلق به نژاد گوسفندان برتر حامل ژن باروری، شماری از شکایات دامداران در خصوص عدم تطبیق ادعای فروشنده با عملکرد میش در مزرعه مشاهده شده است. با این انگیزه‌ی تحقیقاتی، هدف از پژوهش حاضر در گام اول، تلفیق دو تکنیک pcrrflp و pcrsequencing و متعاقب آن، برای پالایش ژنتیکی جایگاه ژنی fecb مرتبط با صفت چندقلوزایی در گوسفندان نژاد بورولا افشاری و گوسفندان دورگ قزلرومانوف می‌باشد و در گام دوم و اصلی، اقدام به بررسی ریسک عدم صداقت احتمالی و همچنین امکان‌سنجی شناسایی تقلبات احتمالی، حین داد و ستد دام در سطح استان آذربایجان شرقی می باشد.مواد و روش‌ها: در پژوهش حاضر، نمونه‌های خون از مجموع تعداد 62 راس میش و قوچ نژاد بورولا افشاری از واحدهای گوسفندداری اطراف تبریز و 30 راس میش دورگ قزل رومانوف اخذ گردید. سپس، در یک گام دو مرحله‌ای مجزا، بعد از تکثیر ناحیه‌ای 190 جفت بازی از ژن bmpr1b توسط واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز، دو روش مولکولی pcrrflp و توالی‌یابی مستقیم سانگر،  بر اساس دستورالعمل آزمایشگاهی روتین، انجام و نتایج ژنوتیپ ثبت گردید و متعاقباً، با استفاده از نرم افزارهای مختلف همچون پاپ ژن و finchtv و mafft به ترتیب، فراوانی ژنوتیپی و اللی و همردیفی توالی‌های مورد تکثیر برای تایید مجدد جهش انجام شد.نتایج: در انجام بخش مولکولی این تحقیق با استفاده از آغازگرهای پیشنهاد شده (wilson et al. 2001)، ناحیه‌ی اگزون شماره‌ی 8 ژن bmpr1b که یک قطعه‌ی 190 جفت بازی است به وسیله‌ی pcr تکثیر شد. سپس با استفاده از آنزیم اندونوکلئاز avaii که آنزیم برشی برای جایگاه fecb بوده و دارای جایگاه شناسایی و برش (g/gwcc) می‌باشد، قطعات تکثیر شده توسط pcr، مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. جایگاه ذکر شده در گوسفندان حامل جهش، باعث برش قطعه‌ی 190 جفت بازی به دو قطعه‌ی30 و 160 جفت بازی می‏گردد. در صورتی که در گوسفندان دارای ژنوتیپ وحشی، آنزیم قادر به شناسایی و برش این جایگاه نیست. در این مطالعه، در مجموع، از 62 راس گوسفند بورولا افشاری، 11 راس دارای ژنوتیپ هموزیگوت برای جهش fecb بودند یعنی دارای دو نسخه از جهش بودند و 51 راس دارای ژنوتیپ هتروزیگوت بوده و فقط یک نسخه از جهش را دارا بودند. در تمامی 30 راس گوسفند دورگ قزلرومانوف نیز هیچ جهشی مشاهده نشد. این نتایج با انجام فناوری توالی‌یابی سانگر در کنار روش pcrrflp تایید شد و انجام همزمان دو روش، باعث افزایش صحت و دقت نتایج تحقیق شد.نتیجه‌گیری: نتایج تحقیق حاضر، نشان داد که یکی از علل عدم تطبیق ژنوتیپ پیش اظهار شده فروشندگان با ژنوتیپ واقعی، خطای قرائت ژنوتیپ و یا تقلبات و ادعای کذب فروشنده می‌تواند باشد. همچنین، تلفیق و کاربری همزمان دو تکنیک مولکولی pcrrflp و توالی‌یابی مستقیم می‌تواند خطای فنی ناشی از ژنوتیپ را تا حد امکان به حداقل خود برساند. علاوه بر این، با اعمال تکرارپذیری بالای مشاهدات، متاسفانه وجود 8.06 درصد ( 5 از 62 حیوان) عدم صداقت و ناسازگاری در ژنوتیپ جایگاه ژنی fecb، به اثبات رسید. ایجاد مراکز پالایش و تعیین ژنوتیپ وابسته به دولت در خصوص تشخیص تقلبات، می تواند به نهادهای نظارتی در خصوص خدمات تعیین ژنوتیپ گوسفندان حاوی ژن باروری کمک کند و این، خود به خود آمار تقلبات را کاهش خواهد داد.

Feasibility study of genetic refinement of litter size in sheep with the aim of reducing possible fraud - A provincial study

ObjectiveRecently, in East Azerbaijan province, while marketing of top sheep carrying fertility genes became suspected, because a number of farmers complained about the claim of the seller due to the low performance of such ewes on the farm. With this research motivation, the aim of the present study in the first step is to combine PCRRFLP and subsequent PCRSequencing methods for genetic refinement of the FecB gene locus associated with litter size in the BooroolaAfshari sheep breed.Materials and methodsIn this study, overall 62 ewes and rams of BooroolaAfshari sheep and 30 ewes of Ghezel Romanov hybrids were obtained from different sheep farms around Tabriz. Then, two separate phase were designed, after amplification of the 190 bp region of the BMPR15 gene by PCR, two molecular PCR RFLP methods and direct sequencing were performed according to routine laboratory instructions. Genotype results were recorded and subsequently, using different software such as POPGENE, FinchTV and MAFFT, the genotypic, allelic, and alignment frequencies of the amplified sequences were performed to confirm the mutation, respectively.ResultsThe results of the present report demonstrated that the source of discrepancy between the identified genotype and the actual genotype can be due to the error of reading the genotype or the seller’s fraud and false claim. Also, the combination and both outputs of both molecular techniques, PCR RFLP and direct sequencing, can minimize the technical error caused by the genotype. In addition, high reproducibility observations confirmed the presence of 8/06% fraud in the FecB gene locus genotype.ConclusionsThe combination of two molecular methods, PCR RFLP and PCRsequencing direct sequencing to detect FecB mutations, has shown acceptable efficiencies, and the establishment of governmentaffiliated genotyping centers for fraud detection can assist regulators in genotyping sheep with fertility genes and moreover may reduce the number of frauds.