بیان موقت و خالص‌سازی پروتئین پروکیموزین در گیاه توتون با استفاده از وکتور ویروسی

هدف: هدف از این تحقیق همسانه‌سازی و بیان پروتئین نوترکیب کیموزین و پروکیموزین در گیاه توتون با استفاده از ناقل ویروس موزائیک تنباکو و خالص‌سازی پروتئین تولید شده بود. مواد و روش‌ها: توالی پروکیموزین بزی از پایگاه داده ncbi دریافت و براساس ترجیح کدونی گیاه توتون بهینه‌سازی گردید. سپس با طراحی آغازگرهای مختلف ژن پروکیموزین و کیموزین تکثیر و در ناقل‌های دوتایی (باینری) و ویروسی همسانه‌سازی و به باکتری آگروباکتریوم تومه‌فاشینس انتقال داده شد. با روش آگرواینفیلتراسیون باکتری حامل ناقل‌های دوتایی و ویروسی به برگ‌های گیاه توتون تزریق گردید. روش وسترن بلاتینگ به منظور بررسی بیان پروتئین مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت نسبی پروتئین‌ها در تشکیل لخته مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: زمانی که ژن پروکیموزین با استفاده از ناقل‌های دوتایی در گیاه توتون بیان گردید، فقط یک باند ضعیف در پروتئین کل استخراج شده مشاهده گردید، ولی زمانی که ژن کیموزین در ناقل دوتایی بیان گردید، در پروتئین محلول نیز باند مشاهده گردید. استفاده از ناقل‌های ویروسی باعث نکروزه شدن برگ‌های گیاه توتون گردید و نتایج مشابهی نیز با ناقل‌های دوتایی بدست آمد به طوری که زمانی که ژن پروکیموزین بیان گردید فقط یک باند در پروتئین کل، ولی زمانی که کیموزین بیان گردید علاوه بر پروتئین کل در پروتئین محلول استخراج شده نیز باند مشاهده گردید. بیشترین میزان بیان با استفاده از سازه ژنی tmvαchymosinhyfc بدست آمد که پروتئین خالص شده دارای فعالیت تشکیل لخته u 8/16 در هر گرم برگ تر بود.نتیجه گیری: اگرچه استفاده از ناقل‌های ویروسی و بیان موقت می‌تواند روش ارزان، سریع و موثری برای تولید پروتئین‌های نوترکیب باشد ولی در تحقیق حاضر نکروزه شدن و مشکلات احتمالی گیاه توتون با کل یا بخشی از ژن پروکیموزین باعث کاهش سطح بیان کیموزین گردید، که تعیین دلایل احتمالی و راه‌های رفع آن‌ها  نیازمند مطالعات بیشتر می‌باشد.

Transient expression and purification of prochymosin in tobacco (Nicotiana benthamiana) using viral vectors

ObjectiveThe aim of present study was transient expression and purification of recombinant caprine chymosin and prochymosin in N. benthamiana leaves using plant binary vectors and tobacco mosaic virus (TMV) vector. Material and MethodsThe caprine prochymosin gene sequence was obtained from NCBI gene bank and optimized at codons for preferential expression in tobacco leaves. The chymosin and prochymosin genes were introduced into the plant binary and viral vectors.  Immunoblotting analyses were conducted to demonstrate expression of chymosin and prochymosin, and the expression level was quantified by milk clotting activity test.ResultsResults indicated that N. benthamiana leave cells cannot process prochymosin correctly and only a weak band observed in extracted total proteins (TPs) which showed no milk clotting activity while leaves infiltrated by p20αchymosin showed a band with chymosin molecular weight and slightly showed milk clotting activity. TMVbased recombinant prochymosin and chymosin expression showed necrosis after 3 days post infiltration (dpi) in agroinfiltrated leaves and after 5 days, leaves completely dried and necrotized. Blotting analysis showed only a band with right molecular weight in TSPs extracted N. benthamiana leaves infiltrated by TMVαchymosin.  Moreover, we subcloned chymosin which expanded with a Nterminal barley alpha amylase signal peptide and a Cterminal hybrid Fc tag which labelled as TMVαchymosinhyFc. The expression level increased gradually from 2 to 5 days after infiltration from 3.3 U/g FW to 16.8 U/g FW but after 5day leaves necrosis started and expression level reduced gradually.ConclusionViral vectors and transient expression can be a cheap, fast and effective method to produce a huge amount of recombinant proteins but it seems chymosin production still needs more research and find the N. benthamiana cells problem with chymosin which leads to necrosis and reduce the expression level for large scale production.