مقایسه اثر ضد ویروسی پپتید لاکتوفرین شتری (clf36) و داروهای نسل جدید بر علیه ویروس هپاتیت c

هدف: عفونت هپاتیت c یکی از شایع ترین بیماری های عفونی مزمن در جهان می باشد و سالانه حدود  3 تا 5 میلیون نفر به این عفونت مبتلا می گردند. متاسفانه با وجود پیشرفت های اخیر، هنوز هم مشکلات گسترده ای برای درمان این افراد وجود دارد و بسیاری از نیازها برآورده نشده است. در نتیجه نیاز مبرمی به استراتژی های درمانی موثرتری برای درمان این بیماری می باشد. یکی از این رویکردهای درمانی جدید، استفاده از پروتئین های نوترکیب است، که هیچ گونه اثرات جانبی برای بیمار نداشته و در عین حال نیز ارزان و قابل دسترس می باشد. در نتیجه هدف از انجام این مطالعه، بررسی اثر ضد ویروسی پپتید نوترکیب clf36 مشتق شده از لاکتوفرین شتری بر علیه ویروس هپاتیت c در شرایط برون تنی می باشد.مواد و روش‌ها: در این مطالعه، ساختارهای سه بعدی پروتئازهای ویروس هپاتیت c (ns2, ns3, ns4a, ns5a و ns5b) و پپتید نوترکیب clf36، تهیه شد. ساختار شیمیایی داروهای ضد ویروسی نیز از پایگاه pubchem دانلود شد. به منظور بررسی پایداری ساختارهای پیش بینی شده، شبیه سازی دینامیک مولکولی با استفاده از نرم افزار gromacs نسخه 2019 و در مدت زمان 100 نانوثانیه انجام شد. سپس به منظور بررسی خاصیت ضد ویروسی پپتید، داکینگ مولکولی برای پپتید و داروها در شرایط استاتیک و با استفاده از نرم افزارهای cluspro و haddock انجام شد. به منظور بررسی پایداری کمپلکس ها، کمپلکس های با مقادیر منفی تر انرژی آزاد اتصال، جهت انجام شبیه سازی دینامیک مولکولی انتخاب شدند.  در نهایت نتایج به دست آمده، در شرایط دینامیکی در نرم افزار گرومکس مورد بررسی قرار گرفت. سپس پپتیدهای مهندسی شده با توجه به نتایج طراحی شدند و توالی بهترین پپتید مهندسی شده جهت سنتز ارسال شد. پس از انجام کلون و بیان پپتید نوترکیب در میزبان مخمری، میزان ic50 پپتید بر روی رده سلول کبد huh7/5 مشخص شد و سلول های آلوده به ویروس با پپتید مورد نظر تیمار شدند و پس از استخراج rna از سلول ها، لود ویروس در نمونه ها  با استفاده از روش real time pcr سنجیده شد.نتایج: از بین نتایج به دست آمده از داکینگ های مختلف انجام شده بین پروتئازهای ویروس و پپتید نوترکیب و داروهای تجاری، مشخص شد که قدرت اتصال پپتید (به طور میانگین 92/99) در مقایسه با سایر داروها (به طور میانگین 54/61) بسیار بیشتر می باشد و این امر بیانگر خاصیت ضد ویروسی بالای پپتید نوترکیب است. نتایج به دست آمده از دینامیک مولکولی نشان داد که مقادیر rmsd و پیوندهای هیدروژنی و انرژی اتصال، برای پپتید clf36 متصل به پروتئازهای ویروس در مقایسه با سایر داروها، حاکی از اتصال قوی تر این پپتید می باشد. علاوه بر این، پپتید مهندسی شده نیز در مقایسه با پپتد طبیعی، فعالیت ضد ویروسی قوی تری را نشان داد (انرژی اتصال 8 واحد قوی تر بود). بررسی عملکرد پپتید در شرایط آزمایشگاهی نیز نشان داد که این پپتید در مقایسه با داروها اثر ضد ویروسی قوی تری دارد به صورتی که توانسته بود به طور کامل از تکثیر ویروس در سلول ها جلوگیری کند.نتیجه‌گیری: نتایج نهایی به دست آمده از این مطالعه، بیانگر این بود که پپتید نوترکیب مهندسی شده، خاصیت ضد ویروسی قوی دارد. هرچند که برای تایید این نتایج، نیاز به انجام مطالعات آزمایشگاهی تکمیلی  می باشد.

Comparison of antiviral effect of camel lactoferrin peptide (CLF36) and new generation drugs against hepatitis C virus

ObjectiveHepatitis C infection is one of the most common chronic infectious diseases in the world and about 35 million people are infected with this infection annually. Unfortunately, despite recent advances, there are still widespread problems for the treatment of these people and many needs have not been met. As a result, there is an urgent need for more effective treatment strategies to treat this disease. One of these new therapeutic approaches is the use of recombinant proteins, which have no side effects for the patient and at the same time are cheap and available.Materials and methodsTo conduct this study, the threedimensional structures of virus proteases (NS2, NS3, NS4A, NS5A and NS5B) and recombinant peptide CLF36, were obtained. The chemical structure of new generation drugs was also downloaded from PubChem. To evaluate the stability of the predicted structures and to ensure the accuracy of the third structure of proteins, molecular dynamics simulations were performed using GROMACS software version 2019 and in a duration of 10 nanoseconds. Then, to evaluate the antiviral properties of the peptide, molecular docking was performed for peptides and drugs under static conditions. To evaluate the stability of the complexes, based on the results obtained from molecular docking, complexes with negative values of free binding energy were selected to perform molecular dynamics simulations. Finally, the obtained results were evaluated under dynamic conditions in GROMACS software. The engineered peptides were then designed according to the results and the sequence of the best engineered peptides was sent for synthesis. After cloning and expression of the recombinant peptide in the yeast host, the IC50 level of the peptide on the Huh7.5 liver cell line was determined and the virusinfected cells were treated with the desired peptide. After extracting RNA from the cells, the virus loaded in the sample. Were measured.ResultsAmong the results obtained from various dockings performed between virus proteases and recombinant peptides and commercial drugs, it was found that the peptidebinding strength (average 99.92) was much higher than other drugs (average 61.54). This indicates the high antiviral property of the recombinant peptide. The results of molecular dynamics showed that the values of rmsd and hydrogen bonds and binding energy for CLF36 peptide bound to virus proteases compared to other drugs indicate a stronger binding of this peptide. In addition, the engineered peptide showed stronger antiviral activity compared to the natural peptide (binding energy was 8 units stronger). Examination of the function of the peptide in vitro also showed that this peptide has a stronger antiviral effect compared to drugs in that it was able to completely prevent the virus from multiplying in cells.ConclusionsThe final results of this study indicated that recombinant peptide, has strong antiviral properties. However, to confirm these results, additional laboratory studies are needed.