طراحی و ساخت سازه‌های بیانی نوترکیب به منظور تولید و ترشح پروتئین‌های نوترکیب در ریشه‌های موئین

هدف: استفاده از سیستم‌های بیانی گیاهی برای تولید پروتئین‌های نوترکیب دارای مزایایی از جمله وجود روش‌های متفاوت تراریختی و کشت، وقوع تغییرات مناسب پس از ترجمه و عدم خطر آلودگی با عوامل بیماری‌زای حیوانی و میکروبی می‌باشد. با این‌حال میزان کم تولید محصول در این سیستم‌های بیانی، همواره به عنوان چالشی عمده مطرح است. سیستم‌های بیانی مبتنی بر ترشح در کشت ریشه‌های موئین، می‌توانند راه‌کار مناسبی برای تولید پیوسته‌ مواد موثره بدون نیاز به تخریب بافت گیاهی باشند و به نوبه‌ خود، موجب سهولت فرآیند خالص‌سازی و کاهش قابل توجه هزینه‌های مربوط به آن ‌شوند. این پژوهش با هدف طراحی و ساخت سازه‌هایی با تلفیق همزمان پیشبر اختصاصی ریشه ntrel1 با سه ترادف نشانه پاتاتین، پکتین متیل استراز و کالرتیکولین برای افزایش بیان اختصاصی پروتئین‌های نوترکیب در کشت ریشه‌های موئین و در ادامه ترشح آنها به درون محیط کشت مایع به انجام رسید.مواد و روش‌ها: توالی نوکلئوتیدی پیشبر اختصاصی ریشه‌ای ntrel1 و پپتیدهای نشانه پاتاتین، پکتین متیل استراز و کالرتیکولین از پایگاه داده ncbi دریافت گردید. توالی این پیشبر به منظور شناسایی عناصر تنظیمی cis دخیل در بیان اختصاصی ریشه‌ای توسط نرم افزارهای place و plant care مورد بررسی قرار گرفت. مطالعات بیوانفورماتیکی به منظور طراحی سازه‌های بیانی pbi121 واجد توالی نوکلئوتیدی پیشبر در ترکیب با پپتیدهای نشانه به انجام رسید و جایگاه‌های برشی مناسب در دو سر قطعات مورد نظر طراحی گردید. پس از دریافت قطعات سنتزی در ناقل puc57، قطعات با واکنش هضم آنزیمی جداسازی شده و در سازه بیانی pbi121 همسانه‌‌سازی شدند.نتایج: بررسی پیشبر ntrel1 نشان داد این پیشبر، غنی از نوکلئوتیدهای at است. این توالی‌ها به دلیل سهولت در تبدیل از شکل دو رشته‌ای به تک رشته‌ای،  موجب بهبود فرآیند شناسایی توسط سیستم‌های رونویسی و  افزایش بیان ژن‌ها می شوند. صحت همسانه‌سازی پیشبر ntrel1 در ترکیب با سه پپتید نشانه پاتاتین، پکتین متیل استراز و کالرتیکولین در سازه بیانی pbi121 با استفاده از واکنش کلونی پی‌سی‌آر، هضم آنزیمی و توالی‌یابی قطعات همسانه‌سازی شده در سازه بیانی pbi121 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، تائید شد.نتیجه‌گیری: از آنجایی که ناقل‌های بیانی مبتنی بر pbi121 نسبت به سایر ناقل‌های بیانی، کارایی بالایی داشته و به طور گسترده در پروژه‌های تراریزش ژنتیکی و بیان پروتئین‌های نوترکیب در گیاهان مورد استفاده قرار می‌گیرند، ناقل‌های نوترکیب ساخته شده در این پژوهش می‌توانند به نحوی موثر برای تولید و ترشح پروتئین‌های نوترکیب در سیستم‌های بیانی، مانند کشت ریشه‌های موئین مورد استفاده قرار گیرند.

Designing and constructing recombinant expression cassettes for production and secretion of recombinant proteins in the hairy root

ObjectiveThe use of plant expression systems to produce recombinant proteins have advantages such as different methods for transformation and culture, occurrence of appropriate posttranslational modifications and no risk of contamination with animal and microbial pathogens. However, low productivity in these expression systems have always been a major challenge. Secretionbased expression systems, such as Hairy Root Cultures (HRCs), is a convenient way to continuously produce active ingredients without the need for plant tissue degradation, which will facilitate the purification process and significantly reduce related costs. This study aimed to designing and constructing vectors carrying NtREL1 root specific promoter in combination with patatin, pectin methyl esterase and calreticulin signal peptides at the same time in order to increase the specific expression of recombinant proteins in hairy root culture and their subsequent secretion into hydroponic medium.  Materials and methodsThe nucleotide sequence of NtREL1 root specific promoter, patatin, pectin methyl esterase and calreticulin signal peptides were retrieved from NCBI database. To identify cis acting regulatory elements involved in specific expression, the NtREL1 sequence was investigated by PLACE and PLANT CARE softwares. Bioinformatics studies were performed to design pBI121 expression vector with NtREL1 promoter in combination with signal peptides and appropriate restriction sites. After receiving the synthetic fragments in pUC57 vector, the fragments were digested by restriction endonuclease and sub cloned in pBI121 expression vector.  ResultsExamination of the NtREL1 promoter showed that this promoter is rich in AT nucleotides. These sequences can improve the recognition process by transcription systems and increase gene expression due to their ease of conversion from doublestranded to singlestranded form. The accuracy of NtREL1 promoter sub cloning upstream of patatin, pectin methyl esterase and calreticulin signal peptides in pBI121 expression vector were confirmed using colony PCR, digestion reactions and sequencing. ConclusionsSince pBI121based expression vectors are more efficient than other expression vectors and widely used in genetic transformation and expression of recombinant proteins in plants, this recombinant vectors can be applied effectively for recombinant protein production and its secretion in expression systems like hairy root culture.