بهینه سازی تخلیص پروتئین نوترکیب خارج غشایی (omp) باکتری عامل بیماری گرینینگ مرکبات

هدف: پروتئین خارج غشایی omp در سطح خارجی پیکره باکتری عامل بیماری گرینینگ مرکبات (candidatus liberibacter asiaticus) وجود دارد. پروتئین مذکور می تواند به عنوان آنتی‌ژن برای تولید انواع آنتی بادی های مونوکلونال و پلی کلونال مورد استفاده قرار گیرد. با این‌حال خالص‌سازی پروتئین‌های غشایی به دلیل وجود ساختارهای آب‌گریز با مشکلات فراوانی همراه می‌باشد. در این راستا، هدف از اجرای پژوهش حاضر، بهینه سازی استحصال و تخلیص پروتئین نوترکیب omp می باشد.مواد و روش‌ها: از سازه بیانی باکتریایی pet28a حاوی ژن omp برای تولید نوترکیب این پروتئین استفاده شد. بیان ژن  omp در سویه rosetta باکتری  e. coli صورت پذیرفت. با توجه به آبگریز بودن پروتئین omp، خالص سازی آن در شرایط واسرشته  مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور از غلظت‌های مختلف سدیم کلراید، اوره و گوانیدین هیدروکلراید در شرایط اسیدی ph  متفاوت استفاده گردید. به منظور دستیابی به پروتئین کاملا خالص نوترکیب، استحصال پروتئین از ژل پلی‌آکریل‌آمید با روش‌های مبتنی بر سونیکاسیون، شستشوی توسط انتشار و الکتروالوشن صورت پذیرفت. بررسی کمیت و کیفیت پروتئین های خالص شده با انجام الکتروفورز sdspage و محاسبه غلظت پروتئین با نرم افزار imagej  انجام گرفت. همچنین برای تایید ماهیت پروتئین خالص شده، آزمون وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی صورت پذیرفت.نتایج: نتایج اولیه نشان داد که استفاده از غلظت 500 میلی‌مولار سدیم کلراید به عنوان یک جزء ضروری در بافرهای استخراج می‌باشد. همچنین استفاده از اوره به عنوان عامل دناتوره‌کننده کارایی دو برابری نسبت به گوانیدین هیدروکلراید در میزان پروتئین تخلیص شده داشت و بدین ترتیب بیشترین میزان پروتئین (450 میکروگرم در میلی‌لیتر) زمانی بدست آمد که غلظت 8 مولار اوره در اجزای بافری تخلیص گنجانده شد. علاوه بر این، نتایج مربوط به جداسازی باند پروتئین از ژل نشان داد که روش الکتروالوشن بهترین کارایی را در بازیابی و جداسازی پروتئین هدف از ماتریکس ژل در مقایسه با روش سونیکاسیون و شستشوی توسط انتشار داشت. نتایج آزمون الکتروفورز پروتئین حاکی از وجود یک پروتئین با اندازه 34 کیلو دالتون متناسب با وزن مولکولی پروتئین omp می باشد. آزمون وسترن بلات نیز موید ماهیت پروتئین نوترکیب در ممبران بود.نتیجه‌گیری: مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از اوره با غلظت 8 مولار، نمک سدیم کلراید با غلظت 500 میلی‌مولار به همراه تنظیم بافر الوشن روی (4) ph در مرحله تخلیص پروتئین می‌تواند به عنوان یک شرایط بهینه برای بدست آوردن بیشترین مقدار پروتئین هدف بکار رود.  همچنین، روش الکتروالوشن به عنوان روش کارآمد جهت استحصال باند پروتئینی از روی ژل آکریل‌آمید معرفی شد.

Optimizing purification processes of recombinant outer membrane protein (OMP) of Candidatus Liberibacter asiaticus causing agent of citrus greening

ObjectiveThe omp (Outer membrane protein) protein located at outer surface of the bacterial membrane body agent citrus greening disease (Candidatus Liberibacter asiaticus). The mentionedprotein can be used as antigen for generating polyclonal and monoclonal antibodies. Therefore, the purification of membrane proteins is exposed to many problems due to presence of hydrophilic structure. The purpose of this study was optimizing recovery and purification of the recombinant omp protein.Materials and MethodsThe pET28a bacterial expression construct containing omp gene was used to recombinant production of the mentionedprotein. The omp gene expression was conducted in E. coli strain RosettaGami2. With considering to be hydrophilic of omp protein, its purification was investigated under denature condition. To attain it, the different concentrations of NaCL, urea and guanidine at the different acidity pH condition was applied. To obtain the pure omp recombinant protein, the protein recovery from polyacrylamide gel was performed by methods based on elution by diffusion, sonication, and electroelution. The evaluation of quality and quantity purified protein was analyzed by SDSPAGE and the protein concentration was calculated by ImageJ software. Also, to validate the purified proteins, Western blot was applied by specific antibody.ResultsPrimary results showed that using the 500 mM NaCL was detected as an essential share in purification buffers. Also, using urea as denature agent had twice the efficiency on the quantity of purified protein more than guanidine hydrocholoride and thus, when 8 m urea supplemented in purification buffer, the highest purified protein was attained (450 µl/ml). Furthermore, the results related to recovery the single band of protein from gel indicated that the electroelution has highest efficient on recovery of the target protein from gel matrix compared to sonication and elution by diffusion methods. The results of SDSPAGE confirmed to appear a protein with 34 kDa related to molecular weight of target protein. Western blot validated the recombinant protein in membrane. ConclusionsThe current study showed that using urea in 8 M, NaCL in 500 mM concentration in purification buffers following adjusting the elution buffer on pH (4) in elution purification step can be apply as an optimized condition to attain the highest target protein concentration. Furthermore, electroelution method introduced as efficient method in order to recovery band of the target protein from polyacrylamide gel matrix.