طراحی و ساخت کاست رمزکننده عامل رشد اپیدرمی انسانی برای بیان در بذر گیاه جو

هدف: گیاهان کارآیی بسیاری در تولید پروتئین‌های ارزشمند دارویی دارند. عامل رشد اپیدرمی انسانی، اثرات بی‌شماری بر روی سیستم‌های مختلف سلولی داشته و نقش مهمی در بهبودی زخم‌ها و اندام‌زایی دارد. هدف از پژوهش اخیر ساخت سازه‌های ویژه تک‌لپه‌ای‌ها برای انتقال بعدی ژن عامل رشد اپیدرمی و تولید انبوه آن در یک گیاه تک‌لپه‌ای خودگشن یعنی جو بود. گیاه جو با داشتن عملکرد پروتئینی بالا و دگرگشنی بسیار پایین، میزبان ایده‌الی برای تولید عامل رشد اپیدرمی است.مواد و روش‌ها: به‌منظور دسترسی به بالاترین میزان بیان عامل رشد اپیدرمی در بذر جو، توالی ژن موردنظر بر اساس ترجیح کدونی گیاه جو با نرم‌افزار cool بهینه و همراه با پیش‌بر اختصاصی دی‌هوردئین سنتز شد. همچنین توالی راهنمای پپتیدی اندامک ذخیره‌ای پروتئین در بذر جو در ابتدای ناحیه رمزکننده قرار گرفت. پس از دریافت قطعه سنتزی در ناقل puc57hvorhegf، آن قطعه توسط آنزیم‌های saci و hindiii از ناقل جدا و در پلاسمید pbi121 همسانه‌سازی شد. در گام بعدی همسانه‌سازی، برای درج توالی ژن موردنظر در ناقل pgh215، به دلیل نبود جایگاه‌های شناسایی یکسان در این ناقل‌ها، از ناقل حدواسط pbi121gus12 استفاده شد. بعد از برش ناقل همسانه‌سازی و pbi121gus12 توسط آنزیم‌های saci و kpni، همسانه‌سازی قطعه موردنظر در pbi121gus12 انجام گرفت. در گام آخر، ناقل pbi121g12hvorhegf و pgh215 با آنزیم‌های kpni و sali هضم شده و توالی موردنظر در مرز راست tdna و قبل از پایان دهنده nos قرار گرفت.نتایج: با استفاده از آزمون کلونی پی‌سی‌آر، الگوی هضم آنزیمی و توالی‌یابی با آغازگرهای رفت‌وبرگشت، درستی همسانه‌سازی و تولید ناقل‌های pbi121hvorhegf واجد ژن hegf با نشانگر کانامایسین و pgh215hvorhegf واجد ژن hegf با نشانگر هیگرومایسین، مناسب برای انتقال ژن در تک‌لپه‌ای‌ها تائید شد.نتیجه‌گیری: ناقل بیانی نوترکیب pgh215 تغییریافته دارای کاست ژنی موردنظر همراه با نشانگر هیگرومایسین می‌تواند برای انتقال ژن موردنظر در تک‌لپه‌ای‌ها و بیان پروتئین نوترکیب در اندام ذخیره‌ای بذر استفاده شود.

Designing and constructing the encoding cassette of human epidermal growth factor for expression in barley seeds

ObjectivePlants are very efficient in producing valuable pharmaceutical proteins. Human epidermal growth factor (hEGF) has numerous effects on various cellular systems, including wound healing, organogenesis, and so on. The present study was carried out with the aim of constructing monocotyledonousspecific vectors for hegf insertion and massproduction in a selfpollinated crop, barley, afterwards. This crop plant, with high protein yield and very low crosspollination, is an ideal host for the production of epidermal growth factor.  Materials and methodsThe hegf sequence was optimized by COOL software, based on the codon preference of the host plant, and synthesized with a specific promoter, Dhordein. The encoding sequence of signal peptide targeting protein storage organelles in barley seeds was included at the beginning of the encoding area. The synthesized gene cassette was isolated from the cloning vector pUC57Hvorhegf by SacI and HindIII and cloned in pBI121. To insert the gene cassette of interest into pGH215, due to the lack of similar restriction sites in pUC57Hvorhegf and pGH215, the intermediate vector, pBI121Gus12, was applied. After digesting pUC57Hvorhegf and pBI121Gus12 by SacI and KpnI, the sequence of interest was incorporated into pBI121Gus12. Finally, the recombinant pBI121Gus12 and pGH215 were digested with KpnI and SalI, and the gene cassette was cloned at the right border of TDNA, behind the NOS terminator. ResultsCloning accuracy and constructing pBI121Hvorhegf and pGH215Hvorhegf vectors bearing kanamycin and hygromycin, respectively, suitable for monocotyledonscrop transformation was confirmed by colony PCR, digestion pattern, and sequencing with forward and reverse primers. ConclusionsThe modified recombinant expression vector pGH215 with the gene of interest carrying the hygromycin gene cassette, giving a high level of ability to select transformed explants, can be used to transfer desired genes in monocotyledons and express those genes in protein storage organelles.