بهینه سازی بیان اگزوتوکسین A (دومین I,Ii)نوترکیب سودوموناس آئروژینوزا، تخلیص و ارزیابی آن در آزمایشگاه

زمینه و هدف: اگزوتوکسین a فاکتور مهم در بیماریزایی سودوموناس آئروژینوزا بوده و خنثی سازی آن در مبارزه با عفونتهای ناشی از آن کمک کننده خواهد بود. بنابراین در این مطالعه بهینه سازی تولید و تخلیص اگزوتوکسین a (دومین i,ii) و ارزیابی اولیه آن بعنوان کاندید واکسن مورد بررسی قرار گرفنه است.مواد و روش کار: بعد از استخراج dna  از سودوموناس آئروژینوزای سویه pao1 و تکثیر با pcr، قطعه ژنی مورد نظر با اتصال به ناقل pet22b به escherichia coli bl21 (e.coli) منتقل و بیان آن با روش sdspage بررسی گردید و پروتئین نوترکیب با روش افینیتی کروماتوگرافی تخلیص شد. واکنش آنتی ژنیک آن با آنتی بادی ضد اگزوتوکسین a و سرم بیماران مبتلا به عفونت سودوموناس آئروژینوزا با روش وسترن بلاتینگ بررسی گردید.یافته ها: بر اساس نتایج این مطالعه قطعه ژنی اگزوتوکسین a (دومین i,ii) سودوموناس آئروژینوزا با اندازه bp 1212 در ژل الکتروفورزمحصول pcr مشاهده گردید که مقایسه توالی ژن کلون شده با توالی ژن اگزوتوکسین سودوموناس آئروژینوزای سویه pao1، صحت توالی را تایید کرد. بیان در e. coli bl21 باعث تولید پروتئین مورد نظر با اندازه تقریبی  kd45 گردید. بیان در شرایط مختلف نشان داد القای 4 ساعت با نیم میلی مولارiptg در دمایc˚ 28 بهترین شرایط تولید پروتئین با غلظت بالا بود. نتایج نشان داد این پروتئین در وسترن بلاتینگ با آنتی بادی ضد اگزوتوکسین a سودوموناس آئروژینوزای و سرم بیماران مبتلا به عفونت سودوموناس بخوبی واکنش نشان داد.نتیجه گیری: سیستم استفاده شده سیستم مناسبی برای تولید اگزوتوکسین a (دومین i,ii) نوترکیب است و می تواند برای تولید این پروتئین در مقیاس بالا مورد استفاده قرار گیرد.

Optimization of expression and in vitro characteristics evaluation of Pseudomonas aeruginosa recombinant exotoxin A (domains I and II)

Background Objectives:  P. aeruginosa exotoxin A plays an important role in virulence of the bacterium and its neutralization can abolish the P. aeruginosa pathogenicity. Therefore, we showed optimization of recombinant production and in vitro antigenic characteristics evaluation of exotoxin A (domains I and II) as a vaccine candidate.Material Methods: In this study, after DNA extraction and lification with PCR, gene fragment was ligated to Pet22b vector and transferred to E.coli BL21. The protein expression was evaluated by SDSPAGE method. The NiNTA affinity chromatography was used for recombinant protein purification. Then, the reactivity of recombinant exotoxin A with antiexotoxin A antibody (Sigma) and sera from P. aeruginosa infected patients was evaluated by western blotting method.Results: Sequencing of cloned gene showed that the sequence of exoA III gene was in accordance with exoA III from P. aeruginosa PAO1. SDSPAGE analysis indicated that expression of recombinant protein with a molecular weight of 45kD. The results showed, 4 hours induction with IPTG = 0.5mM/m in 28˚C is optimum condition for expression protein. Western blot analysis of the purified protein demonstrated that ExoA III could be recognized by antibody against native exotoxin A and the serum of patients with P. aeruginosa infection.Conclusion: These results suggest that recombinant exoA III protein can be produced in the laboratory and this system can be used for large scale production of this protein for subsequent immunological studies.Key words: Pseudomonas aeruginosa vaccine candidate exotoxin Arecombinant vaccine