کلون سازی و بیان ژن آنزیم زایلونات دهیدراتاز از کلوباکتر ویبریوئیدس

هدف: زیست توده لیگنوسلولزی مانند ضایعات کشاورزی )ساقه ی ذرت، تفاله چغندر قند و پوست مرکبات(، یک منبع به طور گسترده فراوان و بالقوه جذاب برای تولید سوخت های زیستی و مواد شیمیایی است.قند d- زایلوز دومین قند فراوان در هیدرولیز لیگنوسلولزی میباشد. امروزه تالش های قابل توجهی برای گسترش کارخانجات سلولی میکروبی به منظور به کار گرفتن از d-زایلوز برای تولید مواد شیمیایی با ارزش افزوده صورت گرفته است. ترکیب آلی d4,2,1- بوتان تری ال )bt( )butanetriol-1,2,4-d )یک ماده شیمیایی حد واسط مهم است که بهطور گسترده در بسیاری از زمینه ها مانند داروسازی، کاغذ، مواد پلیمری و کاربردهای نظامی استفاده می شود. با توجه به اهمیت بسیار زیاد تولید زیستی bt، یک مسیر مصنوعی که توسط چهار مرحله زایلوز دهیدروژناز، زایلونات دهیدراتاز، -2کتواسید دکروکسیالز و آلدئید ردوکتاز کاتالیز میشود جهت تولید bt از d-زایلوز پیشنهاد شده و به کار گرفته میشود. از آنجایی که در اکثر مطالعات انجام شده از ژن زایلونات دهیدراتاز کلوباکتر کرسنتوس استفاده شده است و با توجه به این که کلوباکتر کرسنتوس و کلوباکتر ویبریوئیدس شباهت بسیار باالی ژنی دارند، هدف از انجام این مطالعه کلون سازی و بیان ژن زایلونات دهیدراتاز از کلوباکتر ویبریوئیدس در ای. کلی میباشد. مواد و روش ها: توالی ژنی d-زایلونات دهیدراتاز از باکتری کلوباکتر ویبریوئیدس از بانک اطالعاتی ncbi بهدست آمد و بعد از استخراج ژنوم ک. ویبریوئیدس که از بانک سلولی خریداری شد، با طراحی پرایمرهای اختصاصی به کمک واکنش زنجیرهای پلیمراز ) polymerase reaction chain ) ، ژن مورد نظر تکثیر شد. قطعه ژنی در وکتور بیانی 28pet کلون گردید و سپس با استفاده از روش شیمیایی به سلولهای مستعد سویه ای. کلی 3de (gami-rosetta )انتقال داده شد. پس از القا سلولها، بیان پروتئین نوترکیب به وسیله ی page-sds بررسی گردید. نتایج: با استفاده از آنزیم های محدوداالثر و تکثیر ژن به کمک واکنش زنجیرهای پلیمراز )pcr colony )و توالی یابی، فرآیند کلونینگ و ورود قطعه ژنی به وکتور بیانی 28pet تایید شد. وجود پروتئین نوترکیب توسط page-sds با وزن مولکولی حدود 68 کیلودالتون بررسی گردید و میزان بیان پروتئین نوترکیب، توسط نرم افزار image j 54، درصد تخمین زده شد. نتیجه گیری: تولید زیستی بوتان تری ال نیازمند ساخت یک مسیر متابولیکی متشکل از چند آنزیم می باشد. حضور باکتری coli.e به عنوان سویه هدف و استفاده از سوبسترای ارزان قیمتی همچون بایومس حاوی زایلوز و حضور آنزیم زایلونات دهیدراتاز برای تولید bt با سرعت و میزان باال ضروری میباشد که نتایج مطالعات این پژوهش میتواند در این راستا موثر باشد.

cloning and expression of xylonate dehydratase from caulobacter vibrioides

aim: lignocellulosic biomass such as agricultural wastes (corn stover, sugar beet pulp and citrus peel) is a widely abundant and attractive source for the production of biofuels and chemicals.biofuels are sources of clean and renewable energy that are considered as a potential substitute for non-renewable oil fuels. various methods and processes have been tested by scientists and researchers in this field and the most favorable conditions for producing biofuels from biomass. however, this biomass has not been fully exploited in many parts of the world for biofuel production, especially in developing countries, and there is little relation with crop residues and forest and waste in this area. so much work is still needed to replace fossil fuels with biofuels from biomass. lignocellulosic waste biomass such as cassava peels, sugar beet pulp, and ulva lactuca are suitable materials for bioethanol synthesis.d-xylose, is the second most abundant sugar in lignocellulosic hydrolysates. nowadays, considerable efforts have been made to expand microbial cell factories to use d-xylose for the production of value-added chemicals. d-1,2,4-butanetriol (bt) is an extremely important intermediate chemical, is widely used in many fields, such as pharmaceuticals, paper, polymer materials, and military applications.a molecule 1,2,4-butanteriol (bt) is a polyol with unique chemical properties, which has a stereocenter and can be divided into d-bt (the s-enantiomer) and l-bt(the r-enantiomer). bt is widely used in the military industry, medicine, tobacco, polymer.  a synthetic pathway involving four enzymes—d-xylose dehydrogenase (xdh), d-xylonate dehydratase (xd), 2-keto acid decarboxylase (kdc), and aldehyde reductase (alr)—has been proposed and implemented to produce bt from d-xylose, highlighting its significant role in bioproduction. and because in most studies, the xylonate dehydratase was used in the case of caulobacter.crescentus, and given the very high genetic similarity between caulobacter.crescentus and caulobacter.vibrioides, the aim of this study is to clone and express xylonate dehydratase gene of c.vibrioides in the e.coli. for this purpose, the research was carried out with the aforementioned methods.material and methods:  the xylonate dehydratase gene was retrieved from the ncbi database and amplified using pcr with specific primers after extracting the c. vibrioides genome. the piece of the gene was cloned in the pet28 expression vector and then transferred to the e.coli prepared cells using chemical methods. after the induction of the cells, recombinant protein expression was examined using sds-page. results: by using restriction enzymes, colony pcr and sequencing, the cloning process and the entry of the gene into the pet28 expression vector was confirmed. the presence of the recombinant protein was tested by sds-page gel with a molecular weight of approximately 68 kda and the expression rate of the recombinant protein, estimated by image j software, was 54 percent. conclusion: the bioproduction of butanetriol requires the construction of a metabolic pathway consisting of several enzymes. the presence of the bacterium e.coli as the target strain and the use of cheap substrate such as xylose-containing biomass and the existence of the enzyme xylonate dehydratase are essential for the production of high-speed and high-volume d-1,2,4 butanetriol.