فوق‌بیان ژن گلوتامات سمی‌آلدهیدآمینوترانسفراز گیاه یونجه در گیاه تنباکو و تحلیل نتایج فیزیولوژیک آن

هدف: مسیر بیوسنتز کلروفیل یکی از اهداف مهم ایجاد تغییرات ژنتیکی به‫منظور تغییر سرعت فتوسنتز و رشد گیاهان برای تامین افزایش تقاضای غذا در جمعیت رو به رشد جهان است. در این مطالعه تاثیر فوق بیان ژن gsa یکی از ژن‌های مسیر بیوسنتز کلروفیل بر شرایط فیزیولوژیکی گیاه تنباکو مورد بررسی قرار گرفت. 5-آمینولوولینیک اسید (ala) محصول ژن gsa است. ala پیش‌ساز ساخت تتراپیرول‌ها است. این ترکیب نقش بسیار مهمی در سلول‌های زنده دارد مثلا به‫عنوان رنگدانه‌ها، گیرنده نور (فیتوکروم)، گروه پروستاتیک بسیاری از پروتئین‌ها (مثل سیتوکروم‌ها، هموگلوبین، میوگلوبین و لگ هموگلوبین) و آنزیم‌ها (مثل کاتالاز، آسکوربات، پراکسیداز و غیره) نقش دارند. امروزه ala به‫دلیل استفاده گسترده از آن در کشاورزی، جنگلداری و داروسازی مورد توجه زیادی قرار گرفته است. ala در غلظت‌های پایین فتوسنتز، رشد و نمو، عملکرد و بهره‌وری را افزایش می‌دهد. همچنین ظاهر، رنگ میوه ، کیفیت و طعم محصولات را در گیاهان تیمار شده در شرایط عادی و استرس‌زا افزایش می‌دهد. ala همچنین ویژگی‌های آنتی اکسیدانی، جذب مواد مغذی، راندمان مصرف آب و تعادل اسمزی را در گیاهان بهبود می‌بخشد. مواد و روش‌‌ها: در این تحقیق با توجه به مطالعات بیوانفورماتیکی cdna ژن msgsa گیاه یونجه رقم اصفهانی برای انتقال به گیاه تنباکو رقم xanthi انتخاب گردید. از ناقل بیانی دوگانه گیاهی ‏pbi121‎‏ که دارای ژن مقاومت آنتی‌بیوتیک کانامایسین برای انتخاب در باکتری‌ها و گیاهان، محل‌های برش برای آنزیم‌های saci و bamhi، پروموتر camv35s (پرموتور ویروس موزاییک گل کلم)، توالی خاتمه دهنده ی نسخه‌برداری nos و ژن گزارشگر β-گلوکورونیداز (gus) استفاده شد. پس از ساخت سازه ژنی pbi121-gsa و تایید انتقال سازه با استفاده از سه روش کلون pcr، هضم آنزیمی و ترادف‌یابی سازه مربوطه به اگروباکتریوم تومفسینس سویه  lb4404انتقال داده شد. با استفاده از اگروباکتریوم واجد سازه ژنی، ژن مربوطه به ژنوم گیاه تنباکو منتقل و گیاهان تراریخته روی محیط گزینشی انتخاب شدند و وجود ژن با انجام pcr در گیاهان باززایی شده تایید شد. جوانه‌های تراریخته ریشه‌دار شده به خاک منتقل شدند. میزان بیان ژن gsa در گیاهان تراریخته حاصل با rt-pcr مورد ارزیابی قرار گرفت و میزان رشد و محتوای بیوشیمیایی آن‌ها مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: نتایج نشان داد که رشد گیاهان تراریخته به‫صورت معنی‌داری بسته به میزان بیان ژن gsa افزایش یافت همچنین محتوای ala (آمینولوولینیک اسید)، کلروفیل a، b و کلروفیل کل که محصول بیان ژن مربوطه می‌باشد. همچنین نتایج نشان می‌دهد که محتوای آنتوسیانین‌ها، فلاونوئیدها و ترکیبات فنل گیاهان تراریخته متناسب با میزان افزایش بیان ژن gsa به‫طور معنی‌داری نسبت به گیاهان تیپ وحشی افزایش پیدا کرده است.نتیجه‌گیری: افزایش میزان رشد، محتوای کلروفیل a،b ، کلروفیل کل،  ala، آنتوسیانین، فلاونوئیدها و فنل گیاهان تراریخته متناسب با میزان افزایش بیان ژن gsa است و این بیانگر افزایش توان رشدی و افزایش پتانسیل مقاومت در گیاهان تراریخته تحت تاثیر ژن انتقالی gsa و افزایش محتوایala  است

overexpression of alfalfa glutamate semialdehyde aminotransferase gene in tobacco and analysis of its physiological results

aim: the chlorophyll biosynthesis pathway is a main target for genetic modification to change plant photosynthesis and growth rate to support a greater demand for food in the growing world population. in this study, the effect of overexpression of gsa gene one of gene involved in biosynthesis pathway of chlorophyll on physiological condition of tobacco plant was investigated. 5-aminolevulinate (ala) is product of gsa gene. ala is a precursor for all tetrapyrrole, these components have impotent roles in living cell, as pigments, light receptor (phytochrome), prosthetic group of many different proteins (like cytochromes, hemoglobin, myoglobin, and leghemoglobin) and enzymes (for example catalase, ascorbate, peroxidase and etc.). nowadays, ala has received wide attention for its widespread usage in agriculture, forestry and medication. ala at low concentrations increases photosynthesis, growth, development, yield and productivity, also promoted fruit color appearance and quality and taste of products in treated plants under both normal and stressful conditions. ala also improves antioxidant features, absorption of nutrient, water use efficiency and osmotic balance in plants.materials and methods: in this research, according to bioinformatics studies, msgsa gene cdna of alfalfa (medicago sativa l. cv. isfahani) was selected to transfer to xanthi tobacco (nicotiana tabacum) plant, the binary expression vector pbi121 which has kanamycin antibiotic resistance gene for selection in bacteria and plants, cutting sites for saci and bamhi enzyme, camv35s promoter (cauliflower mosaic virus promoter), nos transcription termination sequences and ß-glucuronidase (gus) reporter gene was used. after constructing the gene construct pbi121-gsa and confirming the transfer of the construct using pcr cloning methods, enzymatic digestion and sequencing were performed, then the corresponding construct was transferred to agrobacterium tumefaciens strain lb4404 using agrobacterium with the gene construct. the corresponding gene was transferred to the tobacco plant genome and the transgenic plants were selected on the medium containing kanamycin and the presence of the gene was confirmed by performing pcr in the regenerated plants. the rooted transgenic sprouts were transferred to the soil. the level of gsa gene expression in the resulting transgenic plants was evaluated by real-time pcr, and their growth rate and biochemical content were also evaluated.results: it was observed that the growth of transgenic plants increased significantly depending on the level of gsa gene expression, and the content of ala (aminolevulinic acid) and chlorophyll a, b and total chlorophyll, which are the products of the corresponding gene expression. the results also showed the content of anthocyanin, flavonoids and phenol of plants have significantly increased in proportion to the increase in gsa gene expression compared to wild type tobacco plants.conclusion: the growth rate as well as the content of chlorophyll a, b, total chlorophyll, ala, anthocyanin, flavonoids and phenol of transgenic gsa plants is proportional to the increase in the expression of the gsa gene. the results from this study indicate that an increase in transgenic growth rate as well as an increase in the secondary metabolites content in transgenic plants were influenced by gsa transferred gene and an increase in the content of ala. these results imply that transgenic tobacco plants expressing msgsa gene had higher resistance potential to stresses than the wild type tobacco plants.