بررسی اثر اگزوزوم‫های مشتق شده از سلول‫های بنیادی مغز استخوان موش کوچک آزمایشگاهی بر بلوغ فولیکول‫های پره آنترال موش نابالغ نژاد nmri‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

هدف: ناباروری یک بحران زندگی است که بیماران را در سراسر جهان تحت تاثیر قرار می دهد، ناباروری به عنوان عدم موفقیت در بارداری پس از 12 ماه فعالیت جنسی تعریف می شود که 15 تا 17 درصد از زوج ها را در جهان تحت تاثیر قرار می دهد و حدود 50 درصد از آنها به عوامل ناباروری زنان مربوط می شود. فعال کردن روند تقسیم میوز در اووسیت و بلوغ آن از اهداف مهم درمانی محققین علوم ناباروری بوده است. امروزه القا رشد و تکامل اووسیت در خارج از بدن یکی از روش هایی است که در فنّاوری کمکی تولیدمثل به کار گرفته می شود. مغز استخوان اندام پیچیده ای است که در آن دودمان های مختلف سلول های خونساز و استرومایی از خون سازی حمایت می کنند. وزیکول های خارج سلولی (evs) که دارای اندازه 20-100 نانومتر می باشند توسط انواع سلول های مختلف در محیط های کشت آزاد می شوند. علاوه بر پروتئین‌ها، اگزوزوم‌ها با مجموعه‌ای از سیتوکین‌ها، قایق‌های لیپیدی خاص مانند فسفوگلیسرید، کلسترول، سرامید، زنجیره‌های چربی-آسیل و همچنین mrnaها، mirnaها، rnaهای غیر کدکننده، trnaها، rrnaها و به ندرت dna غنی می‌شوند هدف از انجام این پژوهش تجربی بررسی تاثیر اگزوزوم های مشتق از سلول های بنیادی مغز استخوان موش کوچک آزمایشگاهی بر بلوغ فولیکول های پره آنترال می باشد. مواد و روش‫ها: اگزوزوم ها از سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش کوچک آزمایشگاهی به روش فلاشینگ جداسازی و کشت داده شدند. شناسایی سلول‌های بنیادی با روش فلوسایتومتری انجام و  جداسازی و خالص سازی اگزوزوم ها به وسیله الترا سانتریفیوژ انجام شد، شناسایی اگزوزوم نیز توسط میکروسکوپ نیروی اتمی(afm) بررسی گردید. اثرات اگزوزوم ها بر زیستایی فولیکول ها با روش mtt مورد سنجش قرار گرفت و همچنین پارامترهای تکوینی از جمله قطر و تشکیل حفره آنتروم در فولیکول ها بررسی و از فولیکول‌ها در روز های صفر، دوم، سوم و چهارم کشت با بزرگنمایی 20 و با میکروسکوپ معکوس عکس برداری گردید و قطر فولیکول ها توسط نرم افزار image j بر حسب میکرومتر اندازه گیری شد. بیان ژنهای gdf-9 و bmp-15 و bmp-7 به عنوان ژن های دخیل در رشد و بلوغ فولیکولها با استفاده از روش real time-pcr بررسی شد. جهت آنالیز داده های این پژوهش از نرم افزار graphpad prism 8 و تست آماری one way anova استفاده شد. نتایج: ارزیابی زیستایی فولیکول‫ها نشان داد در مقایسه با گروه شاهد، فولیکول‫های تحت تیمار با اگزوزوم 25 و 50 و100 میکروگرم بر میلی لیتر افزایش زنده ماندن را نشان می‫دهند، همچنین میزان تشکیل آنتروم افزایش معنی دار در گروه با غلظت 100 میکرو گرم بر میلی لیتر در سطح معنا داری(p<0.01**) نسبت به گروه کنترل نشان داد. قطر فولیکول ها با افزایش غلظت اگزوزوم ها نسبت به گروه کنترل افزایش نشان داد. ژن های gdf-9و bpm-15 و bmp-7 نیز در گروه های تیماری افزایش بیان داشته است. نتیجه گیری: با توجه به یافته های این پژوهش تجربی می توان می‌توان بیان نمود که اگزوزوم های مشتق شده از سلول های بنیادی مغز استخوان موش کوچک آزمایشگاهی دارای اثر مثبت بر زیستایی و بلوغ و همچنین رشد فولیکول های تخمدانی می باشند.

effect of exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells on maturation of preantral follicles of immature nmri mice

aim: infertility is a life crisis that affects patients worldwide. infertility is defined as failure to conceive after 12 months of sexual activity, affecting 15-17% of couples worldwide. and about 50% of them are related to the factors of female infertility. activating the process of meiosis in the oocyte and its maturation has been one of the important therapeutic goals of infertility researchers. today, inducing oocyte growth and development outside the body is one of the methods used in assisted reproduction technology. bone marrow is a complex organ in which different lineages of hematopoietic and stromal cells support hematopoiesis. extracellular vesicles (evs) with a size of 20-100 nm are released by different types of cells in culture media. in addition to proteins, exosomes are enriched with an array of cytokines, specific lipid rafts such as phosphoglyceride, cholesterol, ceramide, fatty-acyl chains, as well as mrnas, mirnas, non-coding rnas, trnas, rrnas, and rarely dna. the purpose of this experimental research is to investigate the effect of exosomes derived from the bone marrow stem cells of small laboratory mice on the maturation of preantral follicles. material and methods: exosomes were isolated and cultured from the mesenchymal stem cells of the bone marrow of small laboratory mice by the flushing method. identification of stem cells was done by flow cytometry method and separation and purification of exosomes was done by ultracentrifuge, identification of exosome was also checked by atomic force microscope (afm). the effects of exosomes on the viability of follicles were measured by the mtt method, and developmental parameters such as the diameter and the formation of the antrum cavity in the follicles were examined and the follicles were examined on days 0, 2, 3 and 4 of culture with 20 magnification and inverted microscope. photographs were taken and the diameter of the follicles was measured in micrometers by image j software. the expression of gdf-9, bmp-15 and bmp-7 genes as genes involved in the growth and maturation of follicles was investigated using real time-pcr method. graphpad prism 8 software and one way anova statistical test were used to analyze the data of this research. results: the evaluation of the viability of the follicles showed that compared to the control group, the follicles treated with exosome 25, 50 and 100 micrograms/ml showed an increase in viability, as well as the rate of antrum formation increased significantly in the group with the concentration 100 μg/ml showed a significant level (p<0.01**) compared to the control group. the diameter of the follicles increased with increasing the concentration of exosomes compared to the control group. gdf-9, bpm-15 and bmp-7 genes also increased in the treatment groups. conclusion: according to the findings of this experimental research, it can be stated that exosomes derived from bone marrow stem cells small laboratory mice have a positive effect on survival and maturity, as well as the growth of ovarian follicles.