بررسی چند شکلی ناحیه its-rdna فوزاریوم بخش‎های elegans و martiella-ventricosum مرتبط با کدوییان با استفاده از مارکر rflp در استان تهران

هدف: هدف از این تحقیق جمع آوری و شناسایی فوزاریوم های مرتبط با گیاهان تیره کدوئیان در مناطق کشت این محصولات در استان تهران و ارزیابی چندشکلی its-rdna rflp به عنوان یک نشانگر مولکولی در بررسی روابط خویشاوندی این گروه از فوزاریوم ها می باشد. مواد و روش ها: در طول فصل زراعی از مناطق عمده‌ی کشت محصولات جالیزی استان تهران، از محل ریشه، طوقه، ساقه تا ارتفاع 15 سانتی متری و همچنین خاک اطراف گیاه (ریزوسفر)، نمونه‌برداری ها به‌عمل آمد. جدایه‌های قارچی بر روی محیط­کشت ppa کشت، و به روش تک اسپور کردن خالص سازی شده و سپس بر اساس ویژگی‌های ریخت شناسی شناسایی شدند. dna ژنومی قارچ‌ها استخراج‌شد. ناحیه ژنومی rdna its جدایه‌های فوزاریوم با استفاده از پرایمرهای its1 و its4، تکثیر شد. محصولات pcr با استفاده از آنزیم‌های sma ι، bgl ιι و mbo ι مورد هضم قرار گرفتند و سپس بر روی ژل آگارز 2/5 درصد بارگذاری شدند. تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار ntsys-pc v2.02 انجام شد. بدین نحو که ابتدا یک ماتریکس داده از وجود (1) یا عدم وجود (0) هر باند برای هر جدایه ترسیم شد. سپس با استفاده از ضریب شباهت sm، ماتریکس فاصله ژنتیکی تولید و بر اساس مقیاس sahn و روش upgma دندوگرام شباهت جدایه‌ها ترسیم شد. نتایج: در مجموع تعداد 95 جدایه فوزاریوم متعلق به گونه های fusarium solani و f. oxysporum شناسایی شد که از این تعداد، 45 جدایه متعلق به f. solani و 50 جدایه به عنوان f. oxysporum تشخیص داده شد. از تکثیر ناحیه بین its1 و its4 در جدایه های f. oxysporum یک ناحیه­ی  bp 25±550 و در جدایه های f. solani ، ناحیه ای به اندازه‌ی bp 25±575 به دست آمد.آنزیم bgl ιι فاقد جایگاه برشی در ناحیه ی its بود. آنزیم sma ι در گونه‌های f. oxysporum بدون جایگاه برشی، ولی در گونه های f. solani دارای یک جایگاه برشی بود و دو قطعه ی 350 و 230 جفت بازی تولید شد. آنزیم mbo ι در برخی جدایه های تشخیص داده‌شده به نام f. oxysporum چهار باند (bp 180،bp 160، bp 130و bp 90 )تولید کرد که این جدایه ها به عنوان f. redolens تشخیص داده شدند و در دیگر جدایه های f. oxysporum دو باند bp 320 و bp 190 تولید شد. آنزیم mbo ι در جدایه های f. solani به استثنای چند جدایه فاقد جایگاه برشی بود. نتیجه گیری: به نظر می رسد، استفاده از روش rdna-rflp با استفاده از آنزیم های برشی sma i و mbo i می تواند روش مناسبی برای تفکیک گونه های فوزاریوم متعلق به دو بخش elegans و martiella-ventricosum از همدیگر و همچنین بررسی تنوع داخل یا بین گونه ای در بخش elegans باشد.

investigation of its-rdna polymorphisms in fusarium of elegans and martiella-ventricosum sections related to cucurbits using rflp marker in tehran province

aim: the aim of this study was to collect and identify fusarium of elegans and martiella-ventricosum sections related to cucurbits plant in tehran province and evaluation the efficiency of its-rdna rflp polymorphisms as a molecular marker in assessment of relationships between these fusaria. materials and methods: during the cropping season, sampling from cucurbit field was done from the root, crown, stem up to height of 15 cm, as well as the soil (rhizosphere). fungal isolates were cultured on ppa culture medium, purified by single sporulation method, and then identified based on morphological characteristics. genomic dna of fungi was extracted. the genomic dna of fusarium isolates was extracted and itsrdna region was amplified with its1 and its4 primers. pcr products were digested with smai, bglπ and mboi restriction enzymes and then loaded on 2.5% agarose gel. data analyses were performed by ntsyspc v2.02 software. at first, a data matrix of the presence (1) or absence (0) of each band was drawn for each isolate. then using the sm similarity coefficient, the genetic distance matrix was produced and the similarity dendogram of isolates was drawn based on the sahn coefficient and the upgma method. results: a total of 95 fusarium isolates belonging to species of fusarium solani and fusarium oxysporum were identified. of which, 45 isolates belonging to f. solani and 50 isolates were identified as f. oxysporum. in this research, based on morphological characteristics, f. redolens isolates were not differentiated from f. oxysporum isolates and both were placed under f. oxysporum group. pcr reproduction of its region result in fragments in size of 550±25 bp in f. oxysporum isolates, and 575±25 bp in f. solani isolates. bgl π enzyme had no cleavage site in its products in both species, neither in f. solani nor in f. oxysporum. smai enzyme had one cleavage site in f. solani isolates and produced two fragments (350bp and 230bp) but had no cleavage site in f. oxysporum isolates. the mboi enzyme in some f. oxysporum isolates produced four fragments (180bp, 160bp, 130 bp and 90 bp), so these isolates called as fusarium redolens. mboi enzyme in others fusarium oxysporum isolates produced two bands (320 bp and 190 bp). mboi enzyme had no restriction site in f. solani isolates. conclusion: it seems that the use of rdnaits rflp marker is a suitable method to differentiate fusarium species belonging to section elegance from those of martiellaventricosum sections. it is more efficient method for studying diversity within and between species in section elegans.