اثر لوواستاتین بر تکثیر سلولی و بیان فاکتور نوروتروفیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان در شرایط آزمایشگاهی

هدف: در سال های اخیر استفاده از سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان (bmscs) در پزشکی بازساختی، مهندسی بافت و ژن درمانی بسیار مورد توجه محققان قرار گرفته است. دسترسی آسان، قابلیت تکثیر و ظرفیت تمایز bmsc بههمراه قابلیت چسبندگی به سطح پلاستیکی و رشد و گسترش در شرایط کشت آزمایشگاهی از ویژگی های این سلول ها به شمار می رود. سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان سلول های بزرگسالی هستند که توانایی تمایز به دودمان مزودرمی دارند و در میان سایر سلول های بزرگسال، می توانند در مهندسی بافت استفاده شوند و کاندیدای مناسبی برای پیوند هستند. داروی لوواستاتین به عنوان یک عامل کاهش دهنده کلسترول و با اثرات آنتی اکسیدانت و به ویژه نوروتروفیک و ضد التهابی می تواند در درمان اختلالات عصبی موثر واقع شود. هدف از این مطالعه بررسی بقا، تکثیر و بیان    ژن های gdnf و oct4 با دوزهای مختلف داروی لوواستاتین در سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان است. فرض بر این است که لواستاتین اثرات محافظت کننده عصبی خود را با القای بیان ژن فاکتور نوروتروفیک و ژن فاکتور نسخه برداری تکثیر سلولی اعمال می کند.  مواد و روش ها: در این مطالعه تجربی از موش صحرایی بالغ نژاد ویستار (wistar) استفاده گردید. در مطالعه حاضر سلول های بنیادی مزانشیمی از استخوان ران و ساق موش صحرایی استخراج و در محیط αmem  کشت شد. bmscsپس از استخراج در محیط αmem  (gibco) غنی شده با 10 درصد سرم (gibco) و پنی سیلیناسترپتومایسین (gibco) یک درصد در فلاسک 25cm2 و تراکم 104×2 کشت داده شده و در شرایط دمایی 37 درجه سانتیگراد و co2 5 درصد نگهداری شدند. سلول های بنیادی مزانشیمی به مدت 24 ساعت در معرض 1 میکرومولار، 5 میکرومولار ، 10 میکرومولار و 15 میکرومولار لوواستاتین بهعنوان تیمار قرار داده شدند. میزان بقا و حیات با روش mtt و تکثیر سلولی با شمارش سلولی توسط رنگ آمیزی با dapi ارزیابی شد. همچنین با روش rtpcr بیان فاکتور نسخه برداری تکثیر سلول های بنیادی oct4 و فاکتور نوروتروفیکgdnf  بررسی شد. نتایج: سلول های بنیادی مزانشیمی به کف ظرف کشت پلاستیکی چسبیدند و به سرعت تکثیر شدند. در ظرف کشت، این سلول ها معمولاً به سه شکل سلول های کروی کوچک، دوکی شکل و فیبروبلاست مانند ظاهر شدند. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که میزان تکثیر در غلظت‌های 5، 10 و 15 میکرومولار لوواستاتین نسبت به گروه‌های کنترل افزایش معنی‌داری را نشان می‌دهد(0/05>p). بیان نیمه کمی ژن فاکتورهای نوروتروفیک مشتق از گلیال(gdnf) و ژن‌های oct4 نشان داد که بین گروه‌های تیمار سلول‌های بنیادی مزانشیمی و گروه کنترل تفاوت معنی‌داری وجود دارد. بنابراین داروی لوواستاتین موجب افزایش حیات و تکثیر سلولی و همچنین بیان mrna ژن oct4 و gdnf در گروه لوواستاتین نسبت به گروه کنترل، گردید (0/05>p). نتیجه گیری: بنابراین استفاده از داروی لوواستاتین برای بهبود شرایط کشت سلول های بنیادی مزانشیمی که برای پیوند و سلول درمانی به کار می رود، پیشنهاد می شود. نتیجه دیگر این است که سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان برای درمان بیماری های تحلیل برنده مغز (نورودژنرتیو) مفید خواهند بود.

The effect of lovastatin on cell proliferation and neurotrophic factor expression of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Aim: In recent years using of Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) in regenerative medicine, tissue engineering and gene therapy is highly regarded. Convenient access, ability to expand and MSC differentiation capacity along with the ability of adhesion to plastic surfaces and invitro growth and development are considered as the characteristic feature of these cells. Bone marrow mesenchymal stem cells possess the ability to differentiate into mesodermal lineage, among other adult cells, can be used in tissue engineering and are good candidates for transplantation. Lovastatin as a lowering cholesterol agent and reducing inflammation, as well as antioxidant and, in particular, neuroprotective effects can be effective in the treatment of neurogenic diseases. The aim of this study was to evaluate the effect of lovastatin on survival, proliferation and expression of GDNF and oct4 genes of Bone marrow mesenchymal stem cells. Lovastatin is presumed to exert their neuroprotective effects by inducing neurotrophic factor gene expression and cell proliferation. Material and methods: In this experimental study, we used 46 week adult Wistar rats. The BMSCs were isolated from rat femurs and tibias and cultured in αMEM. The cell pellet was resuspended in αMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin and streptomycin and cultured in 25cm2 culture flasks at a density of 2 × 104 cells and incubated at 37°C and 5% CO2.  For lovastatin treatment, we exposed MSCs to 1 μM, 5 μm, 10 μm and 15 μm of lovastatin for 24 h. The survival rate of cells was measured by MTT assay. The growth rate and proliferation of cells at 24 hours after culture were assessed by staining with DAPI. The expression of Oct4 and GDNF factors was also evaluated by RTPCR. Results: MSCs were attached to culture plate and were quickly proliferated. In the culture plate, these cells were usually appeared in three forms: small spherical, fusiform and fibroblastlike and flattened. The results of this study indicate that the proliferation rate at 5, 10 and 15 µM lovastatin showed a significant increase compared to control groups (P<0.5). Gene expression density of gelial derived neurotrophic factors (GDNF) and oct4 genes showed that, there were significant differences between MSCs treatment groups and control group (P<0.5). Cell viability and proliferation rate indicate that experimental groups has a higher proliferation rate than control group. Moreover, results showed an increase in mRNA expression for GDNF and Oct4 compared to the control group (P <0.05). Conclusion:Therefore, lovastatin can be used to improve the culture of mesenchymal stem cells, which is used for transplantation and cell therapy. BMSCs may be a useful therapeutic agent for the treatment of neurodegenerative disorders.