طراحی و ساخت ناقل نوترکیب Crispr حاوی ژن Lrrk2 بیماری پارکینسون

هدف: هدف از این مطالعه تخریب ژن کیناز غنی از لوسین شماره 2 lrrk2))، مهم‌ترین ژن درگیر در بیماری پارکینسون با استفاده از تکنولوژی crispr-cas بود.مواد و روش‏ها: مراحل همسانه سازی قطعات راهنما در این پژوهش با استفاده از کیت کلونینگ  grnaسیستم کریسپر (شماره کاتالوگ c8324k شرکت زاور زیست آزما) انجام شد. ابتدا 4 الیگونوکلئوتید برای توالی اگزون 41 ژن lrrk2 توسط نرم افزارساختrna  راهنمای crispr با عنوان  chochopطراحی شدند. این دو  rna) grnasراهنما) در دو طرف اگزون فوق در نظر گرفته شدند. مولکول‌های دو رشته‏ای dna بر اساس دستورالعمل استاندارد در آزمایشگاه ساخته شدند. قطعات دو رشته ای 20 جفت بازی راهنما که برای تشکیل کمپلکس cas9-grna استفاده می‌شوند، با استفاده از آنزیم dna لیگاز به وکتور بیانی یوکاریوتی کریسپر px459 متصل و پلاسمیدهای نوترکیب به درون باکتری e.coli dh5aمیزبان با روش شوک حرارتی منتقل شدند. نتایج آزمایشها به‏وسیله روش‏های rcp و تعیین ردیف and ارزیابی شدند.نتایج: آزمایش های چندگانه pcr با استفاده از پلاسمیدهای نوترکیب به‏عنوان and الگو و توالی‏یابی and، همسانه سازی قطعه‏های کوچک راهنما در پلاسمید بیانی کریسپر را نشان داد.نتیجه‏گیری: نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد، سیستم crispr می‌تواند به‏عنوان یک ابزار قوی فراگیر برای ویرایش و تنظیم بسیاری از ژن‏‌های موثر در بیماری‏ها از جمله بیماری پارکینسون استفاده شود.

Design and Construction of Recombinant CRISPR Vector Harboring LRRK2 Gene for Parkinson’s Disease

Aim: In this study, the alteration of the Leucinerich repeat kinase 2 (LRRK2) gene, as the most important gene involved in Parkinson’s disease, was investigated using CRISPRCas editing technology.Material and methods: Cloning the guide molecules of interest was performed using of gRNA CRISPR cloning kit (Catalog No. C8324K, Zaver Zist Azema). Two sets of forward and reversed gRNA oligonucleotides for exon 41 of the LRRK2 gene were designed using the CHOPCHOP CRISPR guide gRNA designing web software. Doublestranded DNA molecules were made according to standard instructions in the laboratory. 20 basepair DNA segments were used to generate RNACas9 enzyme complex and then ligated into the Px459 CRISPR eukaryotic expression vector using Fermentas DNA ligase enzyme. Recombinant plasmids were transformed into E. coli DH5a host competent cells using of heat shock method.Results: findings by multiple PCR experiments and also DNA sequencing blast analysis showed successful cloning the segments of interest into CRISPR plasmids. Clear PCR bands were in agreement with expected values and DNA sequencing results showed 100% similarity. Conclusion: According to the results, development of CRISPR vector system may be used as a wide and powerful tool for editing and alteration of many encountered genes in different diseases such as Parkinson’s disease.