تولید آزمایشگاهی فرم فعال ایمونوتوکسین هدف‌گذاری شده برعلیه گیرنده فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیت

هدف: هدف از مطالعه‌ی حاضر، تولید پروتئین نوترکیب هیبریدی dt389gcsf به فرم فعال محلول در باکتری e. coli bl21(de3) ، تخلیص و ارزیابی سمیت سلولی آن می‌باشد. مواد و روش‏ها: پروتئین dt389gcsf، با دنباله‌ی 6 هیستیدین در باکتری e. coli bl-21(de3)  در دمای 28 درجه سانتیگراد به ‏فرم محلول بیان شد. سپس از طریق ستون کروماتوگرافی تمایلی نیکل سفاروز تخلیص شد. در نهایت عملکرد پروتئین نوترکیب خالص شده با استفاده از آزمون  ttm  بر روی سلول سرطانی 06lh مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج: میزان بیان و خلوص پروتئین dt389gcsf با استفاده از نرم‌افزار image j، به‏ترتیب در حدود 12 و 80 درصد تخمین زده شد. میزان ic50 پس از 48 ساعت قرارگیری پروتئین dt389gcsf در معرض رده‌ی سلولی، در حدود 0.000019±0.00017 مولار بود. نتیجه‏گیری: با کاهش دما و استفاده از مکانیسم درون سلولی، می‌توان بازتاخوردگی پروتئین هیبریدی dt389gcsf را به‏ شکل مناسب و به ‏فرم فعال مشاهده نمود. در نتیجه در مراحل تولید آزمایشگاهی ایمونوتوکسین‏های مربوطه می‏توان با استفاده از این روش، از مراحل تولید به ‏صورت اینکلوژن‌بادی صرف‏نظر کرد.

LabScale Production of Biologically Active Form of Immunotoxin Targeted against Granulocyte Colony Stimulating Factor

Aim: This study aimed to produce recombinant hybrid protein, DT389GCSF, in E. coli BL21(DE3) in a soluble and active form and to purify it and evaluate its cytotoxicity. Material and Methods: The protein, His6tagged DT389GCSF was expressed in E. coli BL21(DE3) in a soluble form at 28 °C. Then it was purified by affinity chromatography on nickel sepharose column. Finally, the function of purified recombinant protein was evaluated by MTT assay on HL60 cancer cell line. Results: The yield of expression and purification of DT389GCSF were determined at about 12 and 80 percent, respectively, using Image J software. The IC50 value upon 48 hours of exposure of DT389GCSF toward cell line was about 0.00017±0.000019 M. Conclusion: By reducing the temperature and using the intracellular mechanism, the refolding of hybrid protein, DT389GCSF, can be observed in a proper and active form. As a result, in vitro production of relevant immunotoxins, by using this method, the steps of inclusion body production can be neglected.