کلون سازی و بیان ژن میدکاین نوترکیب انسانی در اشریشیاکولای سویه‌ی اوریگامی

هدف: هدف این پژوهش کلون سازی و بیان ژن کد کننده‏ی میدکاین انسانی در اشریشیاکولای بوده که پس از انجام مراحل لازم در مقیاس آزمایشگاهی محقق گردید.مواد و روش‏ها: روش‌ها شامل کشت سلول، استخراج rna، ساخت cdna، تکنیک‌های کلون‌سازی، القای بیان با iptg (ایزوپروپیل‌تیوگالاکتوزیداز)، ارزیابی بیان به‏وسیله‌ی ژل پلی‌اکریل‌آمید و تایید توسط وسترن بلات بود.نتایج: ژن میدکاین در pet21a(+) کلون و سپس به اوریگامی منتقل شد. این فاکتور رشد در کلونی حاوی pet21a(+) نوترکیب پس از 16 ساعت انکوباسیون در دمای 18 درجه سانتی‏گراد با هم زدن در 250 دور در دقیقه، در سطح سیتوپلاسمی بیان گردید. بیان پروتئین 13 کیلودالتونی دارای دم هیستیدینی از طریق وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت.نتیجه‌گیری: با‌توجه به اینکه سویه اوریگامی در ژن های trxb و gor جهش یافته است، سینوپلاسم محیطی اکسید کننده می باشد، به‏همین سبب باعث افزایش تشکیل باندهای دی سولفید می‏شود. بنابراین به‏نظر می‏رسد که پس از بیان میدکاین، باقی مانده‏های سیتوزین به‏صورت محلول باقی می‏مانند. این شرایط باعث به‏وجود آمدن محیط مناسبی برای فولدینگ صحیح پروتئین و حل شدن آن می‏شود.

Cloning and Expression of recombinant human midkine gene in Escherichia coli origami

Aim: The aim of this research was cloning and expression of human Midkine coding gene (mdk) in Escherichia coli that achieved in a laboratoryscale experiment.Material and Methods: Methods were included cell culture, RNA extraction, cDNA synthesis, cloning techniques, induction of expression by IPTG (isopropyl thiogalactosidase), expression evaluation using polyacrylamide gel and confirmation by Western blot techniques.Results: Midkine gene was cloned in pET21a (+) and then transformed into Origami strain of E. coli. This growth factor was expressed in cytoplasmic level by a colony containing pETmdk recombinant after 16 hours incubation at 18°C and 250 rpm mixing. Expression of histidine tagged 13 kD protein confirmed by Western blotting technique.Conclusion: Because Origami strain is trxB and gor genes mutant strain its cytoplasm is an oxidizing environment. Due to this, it enhances disulfide bond forming, therefore it seems that after expression of midkine, cysteine residues make an intramolecular disulfide bridge and remains in soluble form. These conditions provide suitable environment for the proper folding of the protein and consequently solubilization of the protein.