زیست پالایی هم زمان جیوه معدنی و آلی با استفاده از وکتور نوترکیب pet28a(+)-mera-merb

سابقه و هدف: جیوه به دلیل پایداری و هزینه زیاد روش های متداول پالایش یک مشکل بزرگ زیست محیطی در جهان است. روش های زیستی مانند استفاده از بیوراکتورهای مبتنی بر باکتری ها یا آنزیم های آنها یکی از روش های زیست پالایی هستند. برای تجزیه ترکیبات آلی و معدنی جیوه از آنزیم های باکتریایی mera و merb استفاده می شود. این مطالعه با هدف همسانه سازی توام ژن های mera و merb در وکتور بیانی pet28a (+) به منظور تولید آنزیم های فعال mera و merb طراحی گردید.مواد و روش ها: ابتدا ژن های mera و merb از ژنوم باکتری های مقاوم به جیوه جداسازی و در داخل وکتور بیانی pet28a(+) کلون گردید. به منظور ارزیابی درستی همسانه سازی ژن مورد نظر، از روش pcr و هضم آنزیمی استفاده شد. وکتور نوترکیب pet28a(+)-mera-merb به دست آمده به درون باکتری اشریشیا کلی سویه bl21  منتقل شد. برای مشاهده افزایش مقاومت به جیوه معدنی و جیوه آلی در باکتری تراریخته و عملکردی بودن آنزیم تولیدی از وکتور نوترکیب، میزان رشد باکتری های اشریشیا کلی سویه bl21 حاوی وکتور نوترکیب به همراه باکتری های اشریشیا کلی سویهbl21  بدون ژن های mera و merb در محیط حاوی جیوه معدنی و جیوه آلی در مدت 48 ساعت اندازه گیری شدند.یافته ها: رشد باکتری اشریشیا کلی حاوی وکتور نوترکیب در محیط حاوی جیوه معدنی و جیوه آلی در زمان ها و غلظت های مختلف جیوه اندازه گیری و نتایج نشان داد که رشد باکتری های اشریشیا کلی حاوی وکتور بدون ژن هدف تا 12 ساعت پس از افزودن جیوه به شدت در تاثیر محیط حاوی جیوه قرار گرفته و قادر به رشد در مقادیر 10 و ppm 20 جیوه نمی باشند. اما باکتری های حاوی وکتور نوترکیب pet21a(+)-mera-merb در محیط حاوی جیوه رشد مناسبی داشتند. sds-page پروتئین های باکتری حاوی وکتور نوترکیب روی ژل آکریل آمید نشان داد که پس از 16 ساعت القا با iptg 1mm در دمای 37 درجه سلیسیوس بیشترین بیان پروتئین های mera (62 کیلودالتون) و merb (23 کیلودالتون)  مشاهده می شود.نتیجه گیری: نتایج حاصل از توانایی رشد باکتری های اشریشیا کلی حاوی وکتور نوترکیب، عملکرد پروتئین های mera و merb در باکتری های ترارریزش شده را نشان داد. همچنین افزایش مقاومت باکتری نوترکیب به جیوه معدنی و جیوه آلی موجود در محیط بیانگر این مساله است که می توان آلاینده های فلزات سنگین در محیط زیست را با مدیریت مناسب از راه ساخت وکتور نوترکیب پاکسازی نمود.

Bioremediation of both mineral and organic mercury via the construction of recombinant vector pET28a(+)-merA-merB

Background Objectives: Mercury due to stability and the high cost of conventional refinement methods is a major environmental problem in the world. Biological methods such as the use of bacterial-based bio-reactors or their enzymes are one of the bioremediation methods. MerA and MerB bacterial enzymes are used to decompose organic and inorganic compounds of mercury. This study was designed to clone merA and merB genes into the pET28a (+) expression vector for the production of MerA and MerB active enzymes.Material Methods: At first merA and merB genes were isolated from mercury- resistant bacterial genome and subsequently cloned into pET28a(+) expression vector. Confirmation of cloning the target gene was achieved by PCR and restriction enzymes. Then pET28a(+)-merA-merB recombinant vector was transformed into E.coli strain BL21. To assess resistance to inorganic and organic mercury by transformed bacteria and the functionality of the enzyme produced by a recombinant vector, the growth of E.coli strain BL21 containing the recombinant vector and without it were measured by adding mercury into the environment during 48 h.Results: Recombinant bacterial growth in medium containing different levels of inorganic and organic mercury was measured at different times. The result showed that the growth of E. coli containing no target gene in the vector was affected after introducing mercury into the medium till 12 hours so that bacteria would not be able to grow at 10 and 20ppm mercury concentrations. However, transformed bacteria with pET28a(+)-merA-merB vector showed suitable growth in a mercury-containing medium. The SDS-PAGE analysis of extracted proteins from transformed bacteria with pET28a(+)-merA-merB vector on 12.5% acrylamide gel showed the highest MerA (62kDa) and MerB enzymes (23kDa) expression following 16 hours induction with 1mM IPTG at 37ºC.Conclusion: Growth ability of transformed E.coli with recombinant vector indicates MerA and MerB proteins function in transformed bacteria. Furthermore, increasing resistance of recombinant bacteria to inorganic and organic mercury indicates that heavy metal pollution in the environment can be cleaned up with proper management through the construction of a recombinant vector.