Alpha Toxin Purification and Antibody Production Against Local Strain of Clostridium Septicum Nh2

Background: clostridium septicum has played a significant role as a causative agent of many acute fetal diseases in man and animals. alpha-toxin is the main factor in the pathogenesis of c. septicum with hemolytic, necrotic and lethal activities. objectives: the study was designed to evaluate alphatoxin purification and antibody production rate against a local strain of c. septicum nh2 which could be applied in diagnosing kits, potency test of the vaccines, and other related applications. methods: local strain of c. septicum nh2 was cultured in liver broth. alphatoxin in supernatant purified by three steps: the first step was done by 25% and 60% of ammoniums sulfate precipitation and continued by deae-sephadex ion exchange chromatography, and finally finished in gel filtration on sephadex g50. alphatoxin was assayed in all steps and purification procedures were analyzed by sds-page. after immunization of rabbits with alpha toxin and serum collection, immunoglobulin was separated by three purifying steps: ammoniums sulfate, ion exchange chromatography, and gel filtration. serum purification process was evaluated by electrophoresis, double immunodiffusion (did), single radial immunodiffusion (srid), western blot, and sds-page. resutls: sds-page results showed the alphatoxin and antialphatoxin were purified partially. double immunodiffusion and single radial immunodiffusion methods detected the specific antibody. heavy and light chains of antialphatoxin separated by 2me in electrophoresis reacted with 48 kda alpha-toxin during the western blot without any reaction to other proteins in nitrocellulose paper. conclusions: the present study showed a modified protocol for c. septicum alphatoxin and antialphatoxin production. the purification method is more economical and faster than previously reported procedures, and antialphatoxin production is  an advantage in detection of c. septicum infection

خالص سازی آلفا توکسین سویه بومی NH2 کلستریدیوم سپتیکوم و تولید آنتی بادی آن

زمینة  مطالعه: کلستریدیوم سپتیکوم عامل ایجاد بیماری های حاد متعددی در انسان و حیوانات است. آلفاتوکسین مهمترین فاکتور بیماریزایی کلستریدیوم سپتیکوم است و فعالیتهای همولیتیکی، نکروتیکی و کشندگی دارد. هدف: درمطالعه حاضر، خالص سازی آلفاتوکسین سویه بومی کلستریدیوم سپتیکوم NH2 و تهیه آنتی بادی علیه آن انجام شده که می تواند  در  تهیه کیت های تشخیصی ، آزمون توانایی واکسن و موارد مرتبط مورد استفاده قرار گیرد. روش کار: سویه بومی کلستریدیوم سپتیکوم NH2 در محیط جگر کشت داده شد. آلفاتوکسین مترشحه در محیط کشت، طی سه مرحله خالص سازی شد: رسوب دادن با آمونیوم سولفات 25 و 60 % اشباع، کروماتوگرافی تغییر یونی با ستون DEAESephadex و ژل فیلتراسیون بر روی SephadexG50. در تمامی مراحل میزان آلفا توکسین مورد اندازه گیری قرار گرفت و روش خالص سازی با SDSPAGE ارزیابی شد. متعاقب ایمن سازی خرگوش با آلفاتوکسین و تهیه سرم از حیوان، ایمونوگلوبین با یک فرایند سه مرحله ای خالص شد: آمونیوم سولفات، کروماتوگرافی تغییر یونی و ژل فیلتراسیون. عملیات مسیر خالص سازی آنتی بادی به وسیله آزمون های الکتروفورز، ایمونودیفیوژن دوطرفه و شعاعی یکطرفه(SRID) ، وسترن بلات و SDSPAGE مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج: مراحل خالص سازی که با آمونیوم سولفات 25% آغاز و با 60% ادامه یافت موجب حذف بسیاری از پروتئین ها گردید. نتایج کروماتوگرافی تعویض یونی با غلظت های مختلف نمک نشان داد که غلظت 0.4 مولار نمک می تواند از همه بیشتر آلفاتوکسین را از ستون DEAE جدا نماید. آلفاتوکسین در مرحله اول، در محیط کشت باکتری فعالیت مخصوص U/mg 394 را داشت و در نهایت، پس از انجام مراحل خالص سازی فعالیت مخصوصش به U/mg 13666 رسید. روند خالص سازی توانست توکسین را 35 برابر خالص کرده و 47 % توکسین اولیه را تخلیص و بازیابی نماید. نتایج الکتروفورز روی ژل SDSPAGE حاکی از خلوص حدودی آلفاتوکسین بود. نتایج ایمونودیفیوژن دوطرفه و شعاعی یکطرفه وجود آنتی بادی مربوطه را تایید نمود. در فرایند وسترن بلات، دو زنجیره سبک و سنگین ایمونوگلوبین توسط مرکاپتواتانول از هم جدا شده و در الکتروفورز فقط با پروتئین 48 کیلودالتونی بر روی غشاء نیتروسلولزی واکنش داد. نتیجه‌گیری نهایی: نتایج این تحقیق منجر به دستیابی به روش خالص سازی آلفاتوکسین کلستریدیوم سپتیکوم و آنتی بادی علیه آن سریعتر و اقتصادی تر از روش‌های سایر محققین گردید.