بررسی تاثیر فسفیت پتاسیم بر الگوهای بیان برخی ژن‌های القایی در برنج رقم هاشمی در برابر قارچ pyricolaria oryzae

مقدمه و هدف: برنج یکی از گیاهان زراعی راهبردی به ‎شمار می‌رود که نقش مهمی در تامین امنیت غذایی بیش از 50 درصد از جمعیت جهان به‌ویژه در آسیا ایفا می‌کند. بلاست با عامل pyricolaria oryzae یکی از مهم‎ترین بیماری‌های برنج، سالانه تهدیدی جدی را برای رشد این محصول ایجاد می‌کند. القای مقاومت در برنج از طریق عوامل زیستی و غیر زیستی از جمله فسفیت، به‌عنوان یکی از ابزار‌های مدیریتی ایمن و نوین، در سطح جهانی به‌عنوان جایگزینی‌ سازگار با محیط‎زیست مورد استفاده قرارگرفته است و این روش باعث فعال‌سازی مکانیسم دفاعی در گیاهان و افزایش توانایی آن در پاسخ به تهاجم بیمارگرها می‌شود. لذا در این پژوهش، تاثیر فسفیت پتاسیم بر تغییرات بیان چند ژن دفاعی شامل pal، lox، npr1، pr1 و pr5 در سطح رونویسی، در پاسخ به مقاومت برنج رقم هاشمی در برابر عامل بیماری بلاست مورد ارزیابی قرار گرفت.مواد و روش‌ها: این پژوهش در گلخانه به‌صورت اسپلیت‎پلات در زمان در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. رقم هاشمی به‌عنوان رقم بومی رایج منطقه و حساس به بیماری بلاست انتخاب گردید. پس از کاشت گیاهچه‌های همسان در گلدان‌ها، محلول‌پاشی فسفیت پتاسیم رقیق‎ شده با غلظت دو گرم در لیتر و محلول‌پاشی آب مقطر سترون به‌عنوان تیمار شاهد روی گیاهچه‌های برنج در مرحله چهار تا پنج برگی انجام شد. پس از دو روز، سوسپانسیون اسپور قارچ بیمارگر با غلظت 105×5 اسپور در هر میلی‌لیتر و به‎ همراه 0/50 درصد توئین 20 برای مایه‌‌زنی تمام بوته‌ها مورد استفاده قرار گرفت. زمان نمونه‎‌برداری از بافت برگی گیاهچه‌های تیمارشده و شاهد به‌ترتیب در چهار زمان صفر (قبل از مایه زنی با قارچ)، 48، 96 و 144 ساعت بعد از مایه‌زنی بیمارگر انجام شد. شدت بیماری بلاست 10 روز بعد از مایه‌زنی ثبت گردید. به‎ منظور بررسی تغییرات بیان ژن‌های دفاعی، پس از استخراج rna نمونه‌ها و ساخت cdna، از روش quantitative real- time pcr استفاده گردید و ژن ubiquitin به‌عنوان ژن خانه‌دار در نظر گرفته ‎شد. تجزیه‌ آماری داده‌های به ‎دست‎آمده از این آزمایش و مقایسه میانگین داده‌ها به روش دانکن در سطح احتمال 0/10 درصد با نرم‌افزار sas 9.1 و همچنین رسم نمودارها با نرم‌افزار excel 2010 انجام گرفت.یافته‌ها: نتایج تجزیه واریانس داده‌های شدت بیماری بلاست ناشی از اثر فسفیت پتاسیم در مرحله برگی روی رقم هاشمی نشان دادند که گیاهان تیمارشده در مقایسه با گیاهان شاهد، آلودگی بسیار معنی ‎دار کمتری نسبت به بیماری از خود نشان دادند. نتایج ارزیابی اثر تیمار فسفیت پتاسیم بر میزان تغییرات بیان ژن‌های npr1، pr1، pr5، lox و pal در مقایسه با شاهد حاکی از آن بودند که داده‌ها اختلاف معنی‌‌داری با یکدیگر داشتند. مقایسه میانگین‌ها نشان داد که الگوهای بیان ژن npr1، pr5 و lox در همه زمان‌ها، پس از مایه‎ زنی بیمارگر در تیمار فسفیت پتاسیم، افزایش بیان داشت اما حداکثر بیان این ژن‌ها 48 ساعت پس از مایه‎ زنی بیمارگر مشاهده شد. میزان رونوشت ژن‌های npr1، pr5 و lox در تیمار فسفیت پتاسیم در ساعت 48 بعد از مایه‌زنی بیمارگر به‌ترتیب 7/08، 4/2 و 7/28 بود که نسبت به گیاهان شاهد در همان زمان به‌ترتیب 2/36، 2/83 و 5/83 برابر افزایش فعالیت داشتند. فعالیت ژن pr5 در 48 ساعت پس از مایه ‎زنی در هر دو تیمار فسفیت پتاسیم و شاهد با تفاوت معنی‌داری بیشترین مقدار بود، سپس بیان ژن در ساعت 96 کاهش و مجددا در ساعت 144 افزایش داشت اما میزان فعالیت ژن در تیمار شاهد با اختلاف معنی ‎دار کمتر از تیمار فسفیت پتاسیم بود. سطح بیان ژن pr1 در گیاهان تیمارشده با فسفیت پتاسیم و شاهد در زمان 48 ساعت پس از مایه ‎زنی به‌ترتیب با 1/65 و 1/4 برابر افزایش نسبت به زمان صفر بیشترین مقدار را نشان داد. در الگوی بیان ژن pr1 در گیاهان شاهد و گیاهان تیمارشده با فسفیت پتاسیم در ساعت 48 بعد از مایه ‎زنی بیمارگر افزایش و در بقیه ساعات نسبت به زمان صفر کاهش مشاهده شد. با وجود این، میزان بیان ژن در تیمار فسفیت پتاسیم در همه‌ی زمان‌ها بیشتر از شاهد بود. اثر تیمار فسفیت پتاسیم بر افزایش میزان بیان ژن pal معنی‌دار بود. میزان فعالیت ژن pal در تیمار فسفیت پتاسیم، در ساعات 48، 96 و 144 به‌ترتیب 0/58، 2/65 و 0/41 برابر در مقایسه با زمان صفر ارزیابی شد و بیشترین سطح فعالیت این ژن در ساعت 96 پس از مایه ‎زنی بیمارگر بود. اما در تیمار شاهد افزایش سطح بیان ژن pal در ساعت 48 پس از مایه ‎زنی بیمارگر مشاهده شد.نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نقش موثر فسفیت پتاسیم در افزایش بیان برخی ژن‌های دفاعی در گیاه برنج و در نتیجه القا مقاومت و حفاظت گیاه در برابر قارچ p. oryzae را نشان می ‎دهند که از گسترش بیماری بلاست برنج جلوگیری می‌کند. بنا بر این، استفاده از فسفیت پتاسیم به‌عنوان محرک ‌مقاومت می‌تواند به تقویت دفاع گیاه در برابر حملات بعدی عوامل بیماری‌زا کمک کند.

the effect of potassium phosphite on the expression patterns of some defense response genes in the hashemi rice cultivar in interaction with pyricolaria oryzae

extended abstractbackground: rice is considered one of the strategic crops that plays an important role in providing food security to more than 50% of the world's population, especially in asia. blast caused by pyricolaria oryzae, one of the most important diseases of rice, poses a serious threat to rice cultivation every year. induction of resistance in rice via biotic and abiotic factors, including phosphite, as one of the safe and modern management tools, has been used globally as an environmentally friendly alternative, and this method activates the defense mechanism in plants and increases their ability to respond to pathogen invasion. in this study, therefore, the effect of potassium phosphite on the expression changes of several defense genes, including pal, lox, npr1, pr1, and pr5 at the transcriptional level, was evaluated in response to the resistance of the hashemi rice cultivar against the blast disease agent.methods: the split-time experiment in a completely randomized design with three replications was used in this research. after planting the same seedlings in pots, potassium phosphite at a concentration of 2 g/l was used for the foliar spraying of 4-5-leaf seedlings, and sterile distilled water was used for the control treatment. after 2 days, the spore suspension of p. oryzae at a concentration of 5 × 105 spores per ml with 0.05% tween 20 was used to inoculate all plants. leaf tissues of treated and control seedlings were sampled at four times: zero (before fungal inoculation), 48, 96, and 144 hours after pathogen inoculation, respectively. the severity of blast disease was recorded 10 days after inoculation. after extracting rna from the samples and making cdna, quantitative real-time pcr was used to investigate changes in the expression of defense genes, and the ubiquitin gene was considered the housekeeping gene. the statistical analysis and the average comparison using duncan's test at a probability level of 0.01% were done using sas 9.1 software. graphs were drawn with excel 2010 software.results: a significant difference was observed in the disease severity, with less infection in the seedlings treated with potassium phosphite than in the control plants. the evaluation results of the effect of potassium phosphite treatment on the expression changes in npr1, pr1, pr5, lox, and pal genes indicated that the data were significantly different from each other compared to the control. the comparison of the means showed that the expression patterns of npr1, pr5, and lox genes increased at all times after pathogen inoculation in potassium phosphite treatment, but the maximum expression of these genes was observed 48 hours after pathogen inoculation. the transcript levels of npr1, pr5, and lox genes in potassium phosphite treatment at 48 hours after pathogen inoculation were 7.08, 4.2, and 7.28, respectively, with increased activity by 2.36, 2.83, and 5.83 times, respectively, at the same time compared to control plants. pr5 gene activity was significantly highest in both potassium phosphite and control plants 48 hours after inoculation, after which the gene expression decreased at 96 hours and increased again at 144 hours. however, the gene activity was significantly lower in the control treatment than in the potassium phosphite treatment. the expression level of the pr1 gene in plants treated with potassium phosphite and control showed the highest value 48 hours after inoculation, with increases of 1.65 and 1.4 times compared to time zero, respectively. the expression pattern of the pr1 gene showed an increase in control plants, and plants treated with potassium phosphite 48 hours after pathogen inoculation, and a decrease in expression was observed in the rest of the hours compared to time zero. despite this, the gene expression level was higher in the potassium phosphite treatment than in the control at all times. the effect of potassium phosphite treatment was significant in increasing the expression level of the pal gene. the pal gene activity in the potassium phosphite treatment was evaluated as 0.58, 2.65, and 0.41 times at 48, 96, and 144 hours, respectively, compared to time zero, with the highest activity level of this gene observed 96 hours after pathogen inoculation. in the control treatment, however, an increase in pal gene expression was observed 48 hours after pathogen inoculation.conclusion: the results indicate the effective role of potassium phosphite in increasing the expression of some defense genes in rice plants and consequently inducing plant resistance and protection against p. oryzae, preventing the spread of rice blast disease. therefore, using potassium phosphite as a resistance inducer can help strengthen plant defense against subsequent attacks by pathogens.