شناسایی مسیرهای ژنی دخیل در تحمل تنش خشکی انتهای فصل در ژنوتیپ جو dayton/ ranney با استفاده از ترنسکریپتومیکس

مقدمه و هدف: بیان ژن‎ها تحت تاثیر مراحل مختلف رشدی و عوامل مختلف محیطی متغییر است. تنش خشکی در مرحله گل‎دهی و پرشدن دانه که به‎عنوان تنش خشکی پایان فصل شناخته می‎شود، می‎تواند منجر به کاهش شدید عملکرد یا شکست کامل تولید محصول شود. تجزیه و تحلیل ژنتیکی مقاومت به خشکی در مرحله زایشی به‎منظور درک مکانیسم واکنش گیاه به شرایط خشکی در مواجهه با چالش‎های حفظ امنیت غذایی ضروری است. بررسی پروفایل رونوشت ژن‎ها در بافت‎ها و مراحل مختلف رشدی تحت شرایط مختلف تنش‎های محیطی می‎تواند بینشی در مورد مکانیسم‎های مولکولی و نحوه‎ی واکنش گیاهان به تنش ارائه دهد. جو به‎عنوان یک گیاه مدل برای رمزگشایی مکانیسم‎های تحمل به خشکی شناخته شده است و مطالعه مکانیسم‎های مولکولی جو برای اصلاح محصولات مهم است، زیرا توانایی تحمل محدودیت‎های آبی در مراحل گلدهی و پر شدن دانه را دارد. هدف این پژوهش شناسایی ژن‎های دارای بیان افتراقی تحت تنش خشکی پایان فصل در گیاه جو با استفاده از تکنیک rna-seq بود. براساس مطالعه‎ی امینی و همکاران روی 13 ژنوتیپ جو دو ردیفه‎ی بهاره تحت تنش خشکی، ژنوتیپ dayton/ ranney (اصلاح شده توسط icarda) به‎عنوان یک ژنوتیپ متحمل به خشکی شناسایی شد و در این مطالعه برای بررسی پروفایل بیان ژن گیاه جو تحت تنش خشکی انتهای فصل استفاده شد.مواد و روش‎ها: ژنوتیپ جو بهاره dayton/ ranney در مرحله ظهور برگ پرچم در معرض تیمار تنش خشکی 70 درصد تخلیه آب در دسترس قرار گرفت. rna کل از برگ‎های گیاهان شاهد و تنش دیده استخراج و کیفیت rna استخراج شده بررسی شد. پس از توالی‎یابی، آنالیز انجام شد و الگوی بیان ژن‎های دارای بیان افتراقی تحت تنش خشکی پایان فصل به‎دست آمد. همچنین، ژن‌های دارای بیان افتراقی، از نظر عملکردی با استفاده از آنالیز غنی‌سازی ژن بررسی شدند. محل اتصال عوامل رونویسی در توالی راه‎انداز ژن‎های دارای بیان افتراقی با استفاده نرم‎افزار آنلاین plantpan 3.0 شناسایی و فراوانی جایگاه‎های اتصال به‎صورت درصدی از کل جایگاه‎های شناسایی شده گزارش شد.یافته‎ها: تحت تنش خشکی انتهای فصل، در گیاه جو 2920 ژن افزایش بیان و 2289 ژن کاهش بیان معنی‎دار نشان دادند. ژن‎های شناسایی شده در فرایندهای فتوسنتز، متابولیسم کربوهیدرات و لیپیدها، فرایندهای تنظیمی، پاسخ به محرک‎های غیر‎زیستی و تنش، نمو و بلوغ بذر دخیل بودند. همچنین، براساس آنالیز هستی‎شناسی ژن، این ژن‎ها در فرایندهای متابولیکی و بیوسنتزی اسید کربوکسیلیک، متابولیسم ساکارز و گلوکان سلولی، پروتئولیز، فسفوریلاسیون، متابولیسم و بیوسنتز rna و متابولیسم اسیدآمینه خانواده سرین نقش داشتند. از ژ‎ن‎های با بالاترین افزایش بیان تحت تنش خشکی می‎توان به خانواده پروتئین‌های تجمعی در اواخر جنین‎زایی، یک ژن مسیر فنیل پروپانوئید به‎نام آنترانیلات-n-بنزوئیل ترانسفراز 1، ژن زایلوگلوکان اندوترانس گلوکوزیلات/هیدرولاز، پروتئین سرین/ترئونین فسفاتاز، یک ناقل میتوکندریایی آرژینین، یک ژن اندونوکلئاز، آنزیم لاکاز و چندین عامل رونویسی اشاره نمود. همچنین ژن‎هایی که بیشترین کاهش بیان معنی‎داری را تحت تنش خشکی نشان دادند شامل یک کیناز گیرنده حاوی دامنه لکتین نوع l (hv-lecrk)، یک ژن شبه-ریبونوکلئاز 3، عامل رونویسی hec1-like، لیپواکسیژناز القا‎‎شونده با متیل جاسمونات ii، گلوکان اندو-3،1-بتا-گلوکوزیداز giii، آکواپورین pip2-5، پروتئین 70 کیلو دالتونی شوک حرارتی و ژن آسپارتیک پروتئیناز نپنتزین-1 بود. همچنین، دو ژن ناشناخته 2hg0195510 و 4hg0389440 افزایش بیان قابل ملاحظه‎ای را نشان دادند. این ژن‎ها در فرایندهای متابولیکی و بیوسنتزی اسید کربوکسیلیک، پاسخ به محرک‎های غیر‎زیستی و تنش، پاسخ به محرک‎های درون‎زا، پروتئولیز، فسفوریلاسیون، متابولیسم و بیوسنتز rna، فرایند متابولیک پروتئین، متابولیسم اسیدآمینه خانواده سرین و حمل و نقل نقش داشتند. همچنین در ﺳﻄﺢ عملکرد مولکولی، برای کلیه ژن‎های دارای بیان افتراقی، گروهﻫﺎی ﻓﻌﺎﻟﯿﺖ کاتالیزوری و اﺗﺼﺎل، ﺑﯿﺸﺘﺮیﻦ ﺗﻌﺪاد ژن را ﺑﻪ‎ﺧﻮد اﺧﺘﺼﺎص دادﻧد. سایر عملکرد‎های مولکولی شناسایی شده برای ژن‎های پاسخگو به تنش خشکی شامل اتصال به پروتئین، اتصال به نوکلئوتیدی، فعالیت حمل و نقل، اتصال به dna، فعالیت ترانسفراز، کیناز، هیدرولاز و پیروفسفاتاز می‎باشد. علاوه براین، ژن‎های افزایش بیان یافته به‎طور خاص دارای عملکردهای انتقال پیام، عامل رونویسی، تنظیم آنزیم، انتقال مولکولی و فعالیت گیرنده بودند. جایگاه‎های اتصال عوامل رونویسی شناسایی شده در ژن‎های دارای بیان افتراقی به 64 خانواده طبقه‎بندی شدند. بیشترین درصد جایگاه‎های اتصال در ژن‎های افزایش بیان یافته متعلق به عوامل رونویسی erf/ap2 و پس از آن فراوان‎ترین جایگاه‎های اتصال متعلق به خانواده‎ها‎ی عوامل رونویسی bzip، bhlh، dof و gata بود. همچنین فراوان‎ترین جایگاه‎های اتصال در ژن‎های کاهش بیان‎یافته شامل ap2/erf، bes1 ، eil، tcp، myb/sant، gata و dof بود. نتیجه‎گیری: با بررسی بیان ژن تحت تنش خشکی پایان فصل جنبه‎هایی از مکانیسم مقاومت گیاه جو به تنش خشکی که با فعالیت‎های متابولیکی و بیوسنتزی گیاه در مرحله زایشی مرتبط است شناسایی شد. نتایج نشان داد که شبکه‎های ژنی متنوع و پیچیده‎ای در پاسخ گیاه جو به تنش خشکی انتهای فصل نقش داشتند و عمدتاً فرایندهای زیستی مرتبط با فتوسنتز و تولید متابولیت‎های پیش‎ساز و انرژی کاهش و فرایند‎های متابولیکی افزایش یافت. همچنین فرایند پاسخ به محرک در هر دو مجموعه از ژن‎های افزایش و کاهش بیان یافته، مشاهده شد.  

identification of gene pathways involved in tolerance to end-of-season drought stress in the dayton/ranney barley genotype using transcriptomics

extended abstractbackground: the expression of genes changes under the influence of different developmental stages and various environmental factors. drought stress at the flowering and seed-filling stage, which is known as end-of-season drought stress, can lead to a sharp decrease in yield or complete failure of crop production. genetic analysis of drought resistance in the reproductive stage is necessary to understand the mechanism of plant response to drought conditions in the face of the challenges of maintaining food security. assessment of the transcript profile of genes in different tissues and developmental stages under different conditions of environmental stress can provide insight into the molecular mechanisms and plants’ reactions to stress. barley is known as a model plant for deciphering the mechanisms of drought tolerance, and the study of molecular mechanisms of barley is important for breeding crops because it can tolerate water limitations at the flowering and grain-filling stages. this research aimed to identify differentially expressed genes in barley under end-of-season drought stress using the rna-seq technique. based on the study of amini et al. on 13 genotypes of spring two-row barley under drought stress, the dayton/ranney genotype (modified by icarda) was identified as a drought-tolerant genotype. thus, they were used in this study to investigate the gene expression profile of barley under end-of-season drought stress.methods: the dayton/ranney spring barley genotype was subjected to drought stress treatment (70% available water depletion) at the stage of flag leaf emergence. total rna was extracted from the leaves of the control and drought-treated plants, followed by qualifying the extracted rna. after sequencing and analyzing, the expression profiles of differentially expressed genes were obtained under end-of-season drought stress. moreover, the differentially expressed genes were functionally investigated using gene ontology enrichment analysis. the binding site of transcription factors in the promoter sequence of differentially expressed genes was identified using plantpan 3.0 online software, and the frequency of binding sites was reported as a percentage of all identified sites. results: under end-of-season drought stress, 2920 and 2290 genes showed significant increases and decreases in expression, respectively, in barley plants. the identified genes were involved in the processes of photosynthesis, carbohydrate and lipid metabolism, regulatory processes, response to abiotic stimuli and stress, seed development, and maturation. based on gene ontology analysis, these genes were involved in the metabolic and biosynthetic processes of carboxylic acid, sucrose, and glucan cellular metabolism, proteolysis, phosphorylation, rna metabolism and biosynthesis, and serine family amino acid metabolism. among the genes with the highest increase in expression under drought stress are the family of abundant proteins in late embryogenesis, a phenylpropanoid pathway gene called anthranilate n-benzoyltransferase protein 1, the xyloglucan-endotrans-glucosylate/hydrolase gene, protein serine/threonine-phosphatase, a mitochondrial arginine transporter, an endonuclease gene, laccase enzyme, and several transcription factors. besides, the genes that showed the most significant decrease in expression under drought stress include an l-type lectin-containing receptor kinase (hv-lecrk), a ribonuclease iii-like gene, the hec1-like transcription factor, methyljasmonate ii -inducible lipoxygenase, glucan endo-1,3-beta-glucosidase giii, pip2;5 aquaporin, 70-kda heat shock protein (hsp70), and an aspartic proteinase nepenthesin-1 gene. moreover, two unknown genes 2hg0195510 and 4hg0389440 showed significant increases in expression. these genes are involved in the metabolic and biosynthetic processes of carboxylic acid, response to abiotic stimuli and stress, response to endogenous stimuli, proteolysis, phosphorylation, rna metabolism and biosynthesis, the protein metabolic process, and serine family amino acid metabolism and transport. at the level of molecular function, the groups of catalytic activity and connection assigned the largest number of genes to themselves for all the genes with differential expression. other molecular functions identified for genes responsive to drought stress include protein binding, nucleotide binding, transport activity, dna binding, transferase, kinase, hydrolase, and pyrophosphatase activity. in addition, these increased genes expressed specifically had the functions of message transmission, transcription factor, enzyme regulation, molecular transport, and receptor activities. the binding positions of transcription factors in genes with differential expression were classified into 64 families. the highest percentage of binding sites in the up-expressed genes belongs to erf/ap2 transcription factors, followed by the most abundant binding sites belonging to the transcription factor family of bzip, bhlh, dof, and gata. furthermore, the most abundant binding sites in the down-expressed genes included ap2/erf, bes1, eil, tcp, myb/sant, gata, and dof.conclusion: by evaluating the gene expression under end-of-season drought stress, aspects of the resistance mechanism of barley to drought stress were identified that are related to the metabolic and biosynthetic activities of the plant in the reproductive stage. the results show that diverse and complex gene networks play a role in the response of the barley plant to end-of-season drought stress, which mainly decreased the biological processes related to photosynthesis and the production of precursor metabolites and increased the metabolic processes. additionally, the response process to the stimulus was observed in both sets of increased and decreased expressed genes.