افزایش بیان ژن‌های درگیر در مسیر بیوسنتز تانشینون ها در گیاهان تتراپلوئید مریم‌گلی (salvia officinalis l.)

چکیده مبسوطمقدمه و هدف: پلی پلوئیدی یکی از عوامل اصلی سازگاری در گیاهان است که می تواند تولید متابولیت‌های ثانویه را در گیاهان افزایش دهد. مریم گلی (salvia officinalis l.) گیاهی چند ساله از خانواده lamiaceae با سابقه طولانی استفاده در صنایع دارویی است و تانشینون ها از ترکیبات فعال حیاتی هستند که در این گیاه تولید می شوند. این مطالعه با هدف تجزیه و تحلیل بیان ژن های درگیر در مسیر بیوسنتز تانشینون ها در گیاهان دیپلوئید و تتراپلوئید مریم گلی و مقایسه بین آنها انجام شد.مواد و روش ها: پلی پلوئیدی در مریم گلی از طریق تیمار بذور آن با کلشی سین 0/5 درصد به مدت 24 ساعت القاء شد و گیاهان تترا پلوئید با استفاده از فلوسیتومتری، مشاهدات کروموزومی، خصوصیات مورفولوژیکی و تعداد روزنه انتخاب و تایید شدند. استخراج rna از برگ نمونه های گیاهی دیپلوئید و تتراپلوئید مریم گلی، سنتز cdna و سپس بررسی بیان ژن‌‌های درگیر در مسیر بیوسنتز تانشینون ها شاملksl ،ippi ، cmk و dxr با استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی (real time pcr) انجام شد. به منظور بررسی بیان ژن‌‌‌‌های مورد نظر با روش rtpcr در نمونه‌های برگی مریم گلی، از ژن 18srrna به عنوان ژن مرجع برای نرمال سازی داده‌‌ها استفاده شد. برنامه حرارتی برای تکثیر ژن‌‌های مورد نظر توسط روش real time pcr، شامل فعال‌‌سازی اولیه آنزیم، مرحله واسرشت‌‌سازی و اتصال آغازگرها بود. صحت تکثیر محصول مربوط به هر یک از ژ‌‌ن‌‌ها توسط منحنی ذوبی مربوط به هر ژن تایید و درستی تکثیر توسط الکتروفورز ژل مورد بررسی قرار گرفت.یافته ها: بررسی کیفیت rnaهای استخراج شده با ژل آگارز یک درصد نشان دهنده کیفیت نسبتاً خوب rnaهای استخراج شده بود. منحنی های ذوب به دست آمده از واکنش pcr در زمان واقعی با استفاده از آغازگرهای مستقیم و معکوس برای ژن های هدف نشان داد که آغازگرها در دمای مشخص شده به درستی به جایگاه های هدف متصل شده و باعث تکثیر اختصاصی آنها می شوند. نتایج واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی نشان داد که بیان ژن های درگیر در مسیر بیوسنتز تانشینون ها شاملksl ،ippi ،cmk و dxr در گیاهان تتراپلوئید به طور قابل توجه و معنی داری در مقایسه با گیاهان دیپلوئید افزایش می یابد.نتیجه گیری: در گیاهان تتراپلوئید بیان ژن های درگیر در بیوسنتز تانشینون‌ها افزایش یافت و این می‌تواند تولید این متابولیت های ثانویه را افزایش دهد. تجزیه و تحلیل بیان ژن در سری های مختلف پلی پلوئیدی می تواند شناخت ما را از سازوکار مولکولی بیوسنتز متابولیت های ثانویه و بهبود تولید آن ها از طریق القای پلی پلوئیدی افزایش دهد.

Enhanced Expression of Genes Involved in the Biosynthesis Pathway of Tanshinones in Tetraploid Plants of Salvia Officinalis L.

Extended AbstractIntroduction and Objective: Polyploidy is one of the main factors in plant adaptation that can increase secondary metabolites production in plants. Salvia officinalis L. is a perennial plant from the Lamiaceae family with a long history of use in the medicinal industry. Tanshinones are crucial active compounds biosynthesized in Salvia. This study was aimed to analyze the expression of genes involved in the tanshinones biosynthesis pathway in diploid and tetraploid sage plants and compare between them.Material and Methods: polyploidy in S. officinalis was induced by seed treatment with 0.5% colchicine for 24 h, and tetraploid plants were selected and confirmed by flow cytometry, chromosomal observations, morphological characteristics, and the number of stomata. RNA was extracted from the leaves samples of diploid and tetraploid plants of sage and then cDNA synthesis and the gene expression analysis of genes involved in the biosynthesis of tanshinones including KSL, IPPI, CMK, and DXR genes was performed using realtime PCR. In order to investigate the expression of genes by RTPCR in sage leaf samples, the 18srRNA gene was used as a reference gene to normalize the data. The thermal program for amplification of the target genes by the RTPCR method included the initial activation of the enzyme, the steps of denaturation, and binding of primers. The amplification accuracy of the genes product was confirmed by the melting curve of each gene and the amplification validity was checked by gel electrophoresis.Results: Evaluation of the quality of extracted RNAs with 1% agarose gel showed a relatively good quality of the extracted RNAs. The melting curves obtained from the RTPCR reaction using forward and reverse primers for the target genes showed that the primers bind correctly to the target sites at the specified temperature and cause their specific amplification. The results of RTPCR showed that the expression of the genes involved in the biosynthesis pathway of tanshinones including KSL, IPPI, CMK, and DXR genes in tetraploid plants was significantly increased compared with diploids. Conclusion: In tetraploid plants, the expression of genes involved in the biosynthesis of tanshinones increased and this could increase the production of these secondary metabolites. Analysis of gene expression in different polyploidy series can increase our knowledge of the molecular mechanisms of biosynthesis of secondary metabolites and improve their production through polyploidy induction.