شناسایی سریع گونه گوسفند (ovis aries) در نمونه گوشت با استفاده از روش تکثیر هم دما

سابقه و هدف: با افزایش مصرف فرآورده های گوشتی، موارد تقلب در گوشت بیشتر و فراگیرتر شده است. یکی از اشکال رایج تقلب، جایگزینی گوشت های قرمز کم ارزش، مانند گوشت بز یا گاو، به جای گونه های با ارزش تر مانند گوشت گوسفند است. در نتیجه، تقاضای فزاینده ای برای روش های سریع و دقیق برای شناسایی گونه های گوشتی وجود دارد. در حالی که روش‌های مبتنی بر پروتئین و dna، مانند elisa و pcr، ابزار ارزشمندی برای شناسایی گونه‌ها هستند، زنجیره کوتاه تولید و مصرف فرآورده‌های گوشتی نیاز به آزمایش‌های سریع و دقیق دارد که می‌تواند در محل مورد نیاز انجام شود. آزمایشگاه های مجهز در این مطالعه، ما از تکثیر هم‌دما با واسطه حلقه (lamp) برای شناسایی اختصاصی گوشت گوسفند استفاده کردیم. مجموعه ای از چهار پرایمر با هدف قرار دادن ژن سیتوکروم b میتوکندریایی (cytb) طراحی شد. اختصاصیت و حد تشخیص این پرایمرها با روش استاندارد pcr که بیشتر در آزمایشگاههای کنترل مواد غذایی متداول است، بررسی و مقایسه شد.مواد و روش ها: در این پژوهش، برای شناسایی اختصاصی نمونه‌ی گوشت گوسفند، با استفاده از نرم‌افزار primerexplorer، مجموعه‌ی 4 عددی از آغازگر های lamp برای ژن cyt b طراحی شد. dna نمونه بافت های گوشتی با استفاده از روش naoh استخراج و برای استفاده در مراحل بعدی بکار برده شدند. به منظور تعیین اختصاصی بودن آغازگرها، آزمون lamp برای پنل نمونه های هدف و غیرهدف انجام شد. همچنین به منظور تعیین حد تشخیص آغازگر های طراحی شده و مقایسه‌ی دو روش lamp و pcr با همدیگر، دو آزمون یاد شده برای سری رقت تهیه شده از dna گوسفند انجام و نتایج با هم مقایسه شدند. در انتها برای بهینه سازی کیت تشخیصی برای شرایط محیط خارج آزمایشگاهی، نتایج با رنگ syto 24 نیز مشخص شدند.یافته‌ها: نتایج کسب شده نشان دادند آغازگر های اختصاصی lamp قادر به شناسایی دقیق گوشت گوسفند از گوشت های غیر هدف دیگر است. همچنین روش آزمایشگاهی طراحی شده در این تحقیق قابلیت شناسایی اختصاصیdna گوسفند به میزان pg µl-1.17 در کمتر از نیم ساعت از زمان نمونه برداری را دارا است که این میزان ، قدرت تشخیص ده برابری نسبت به روش pcr را نشان داد. از طرفی دیگر، با استفاده از نتایج بدست آمده از بکارگیری رنگ syto 24، استفاده‌ی موثر از این روش در محیط خارج آزمایشگاه اثبات شد چرا که استفاده از این روش برایpcr به دلیل محصول کمتر نسبت به روش lamp مقدور نیست.نتیجه‌گیری: این روش به دلیل سادگی و سهولت تجهیزات، حساسیت بالا، عملکرد خاص بین گونه های نزدیک و زمان واکنش کوتاه، پتانسیل قابل توجهی برای تشخیص تقلب گوشت، به ویژه در مکان های دور با دسترسی محدود به آزمایشگاه و پرسنل تحصیل کرده دارد.

rapid identification of sheep species (ovis aries) in meat samples using isothermal amplification method

background and objectiveswith the rising consumption of meat products, incidents of meat adulteration have become more prevalent and universal. one common form of adulteration is the substitution of lower-value red meats, such as goat or beef, for the more valuable species such as sheep meat. consequently, there is a growing demand for rapid and accurate methods to identify meat species. while protein- and dna-based methods, such as elisa and pcr, are valuable tools for species identification, the short production and consumption chain of meat products necessitates rapid and accurate, point-of-care tests that can be conducted outside of well-equipped laboratories. in this study, we employed loop-mediated isothermal amplification (lamp) for the specific identification of sheep meat. a set of four primers was designed targeting the mitochondrial cytochrome b (cyt b) gene. the specificity and detection limit of these primers were evaluated and compared to the standard pcr method which is more common in food control laboratories.material and methodsin this study, a set of four lamp primers targeting the cyt b gene was designed using primerexplorer online software for the specific identification of sheep meat samples. genomic dna was extracted from raw tissue samples using the naoh method (alkaline lysis) and used in subsequent analyses. to assess primer specificity, lamp assays were performed on a panel of target and non-target samples. other than that, to determine the limit of detection of the designed primers and to compare the lamp and pcr methods with each other, both assays were conducted on a serial dilution of sheep dna. finally, to optimize the diagnostic kit for field conditions, results were visualized using syto 24 dye.resultsthe results demonstrated that the designed lamp primers were highly specific in identifying sheep meat from other non-target species. moreover, the developed assay exhibited exceptional sensitivity, detecting as little as 17.1 pg/µl of sheep extracted dna within 30 minutes of sampling, which represents a ten-fold increase in sensitivity compared to the conventional pcr method. additionally, the use of syto 24 dye confirmed the feasibility of employing this method in field conditions, as the lower pcr product yield compared to lamp renders syto 24 visualizations challenging in pcr assays.conclusiondue to its simplicity and easiness of equipment, high sensitivity, specific function between close species and short amount of reaction time, this method holds significant potential for detecting meat adulteration, particularly in remote locations with limited laboratory access and educated personnel.