بررسی خواص ضدمیکروبی و مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ در جامعه میکروبی یک پنیر سنتی

سابقه و هدف: حضور ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک در پنیرهای محلی، به دلیل خطر مهاجرت ژن‌ها، افزایش مقاومت به آنتی بیوتیک‌ها در مصرف کنندگان و درنتیجه بی‌اثر شدن داروهای مربوطه در طی دوره درمانی مطلوب نیست. اخیرا، مطالعات نشان داده است که تقاضای پنیرهای محلی حاصل از شیر خام افزایش یافته است. به علاوه این نگرانی وجود دارد که با مصرف این پنیرها احتمال انتقال ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک از طریق باکتری‌ها به خصوص گونه‌های انتروکوکوس به مصرف کنندگان افزایش یابد. البته محصولات تخمیری سنتی ممکن است حاوی فلور میکروبی ذاتی با ویژگی‌های مفید منحصر به فرد شامل تولید متابولیت‌های ضدمیکروبی و مقاومت به فاژها باشند که برای صنایع لبنی بسیار مهم است. قابلیت تولید باکتریوسین‌ توسط فلور میکروبی مسئول تخمیر پنیرهای حاصل از شیرخام بسیار مهم است زیرا از رشد باکتری‌های بیماری زا جلوگیری می‌کند. از این رو، هدف این مطالعه بررسی حضور فلور میکروبی مقاوم به آنتی‌بیوتیک در پنیرهای محلی حاصل از شیر خام و همچنین بررسی خواص مفید آن ها از جمله تولید متابولیت‌های ضدمیکروبی بود.مواد و روش ها: پنیر حاصل از شیر خام براساس یک دستورالعمل سنتی تهیه گردید. برای جداسازی انتروکوکوس‌ها، از محیط‌kaa آگار و سپس گرمخانه‌گذاری به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد استفاده شد. رقیق‌سازی پنیر در محلول رینگر تا رقت 10⁻⁸ انجام شد. جهت جداسازی انتروکوکوس‌ها، 100 میکرولیتر از نمونه رقیق شده روی kaa آگار کشت گردید و سپس به مدت 48 ساعت تحت شرایط بی هوازی در 37 درجه سانتی گراد گرمخانه‌گذاری شد. جدایه‌های کاتالاز منفی و گرم مثبت توسط تست‌های فیزیولوژی (رشد در نمک با غلظت‌های 6.5درصد و 18درصد ، phهای 9.6 و 4.4، دماهای 10 و 45 درجه سانتی گراد و تولید گاز) به صورت فنوتیپی در سطح جنس شناسایی شدند. بعد از تشخیص فنوتیپی جدایه‌ها در سطح جنس، شناسایی انتروکوکوس‌ها براساس روش مولکولی وابسته به کشت توسط pcr و سپس توالی‌یابی انجام شد.dna استخراج شده از پنیر توسط تکنیک ngs تکثیر و توالی‌یابی گردید. داده‌های متاژنوم برای ژنوم مقاوم به فاژها و آنتی‌بیوتیک‌ها، قابلیت تولید باکتریوسین و ترکیبات آنتی‌اکسیدانی آنالیز شدند. به علاوه، مقاومت جدایه‌ها به آنتی‌بیوتیک و خواص ضد میکروبی عصاره فاقد سلول حاصل از پنیر بررسی شدند. یافته ها: در کل20 باکتری از پنیر جدا شد و براساس تشخیص مولکولی شامل 60درصد انتروکوکوس مالودوراتوس، 5درصد انتروکوکوس فکالیس، 5درصد انتروکوکوس دورانس و 30درصد سایر گونه‌های انتروکوکوسی بودند. همچنین، آنالیز متاژنومیکس نشان داد که جامعه انتروکوکوسی پنیر شامل 72درصد انتروکوکوس مالودوراتوس، 6درصد انتروکوکوس فکالیس، 13درصد انتروکوکوس ایتالیکوس و 10درصد سایر گونه‌های انتروکوکوسی است و میکروبیوم آن مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌ها و باکتریوفاژها بوده و دارای پتانسیل تولید ترکیبات آنتی اکسیدانی و ضدمیکروبی نظیر پلانتاریسین بود. به علاوه، تست‌های آزمایشگاهی نیز مقاومت آنتی‌بیوتیکی و خواص ضدمیکروبی جدایه‌ها را تایید کرد.نتیجه گیری کلی: این مطالعه نشان داد که برخی پنیرهای محلی می‌توانند عامل انتقال ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک به انسان باشند و بایستی مصرف این نوع پنیرها محدود گردد.

evaluation of antimicrobial and antibiotic resistance properties of microbial community in a traditional cheese

background and objectives: the presence of antibioticresistant genes in local cheeses is not desirable due to the risk of gene migration, increased resistance to antibiotics in consumers, and therefore the effectiveness of related drugs during the treatment period. recently, the studies showed that the demand of local cheeses made from raw milk have increased. however, there is concern that consumption of these cheeses could increase the risk of antibioticresistant‌ genes transfer‌ through bacteria especially‌ enterococcus spp to consumers. of course, traditional fermented products may contain intrinsic microbial flora with‌ unique useful properties, including the production of‌ antimicrobial metabolites and resistance to phages, which is very important for the dairy industry. the ability of bacteriocin production by the microbial flora that responsible for fermentation of cheeses made from raw milk is very important because it prevents the growth of pathogenic bacteria. therefore, the aims of this study were the evaluation of the presence of antibioticresistant microbial flora of local cheeses made from raw milk and the investigation of the useful properties such as the presence of its antimicrobial metabolites.materials and methods: cheese made from raw milk was produced based on a traditional recipe. for isolation of enterococcus spp., kaa agar was used, followed by incubation for 48 h at 37°c. the serial dilution of cheese was carried out until the final dilution of 108 in ringer. for isolation of enterococcus spp., a 100 µl of diluted sample was cultured on kaa agar, then incubated for 48 h under anaerobic conditions at 37°c. the catalasenegative and grampositive isolates were phenotypically distinguished at genus level using physiological tests )growth at salt concentrations 6.5% and 18%, ph 9.6 and 4.4, temperatures 10°c and 45°c and gas production. after phenotypic detection of isolates at genus level, culturedependent characterization through pcr and subsequently sequencing was carried out. dna extracted from cheese was proliferated and sequenced by ngs technique. the metagenomics data were processed for phage resistance, antibiotic resistance, bacteriocin and antioxidant components production. furthermore, antibiotic resistance of isolates and antimicrobial properties of cell free supernatant (cfs) from cheese were evaluated.results: a total of 20 bacteria were isolated from cheese and molecularly identified as enterococcus malodoratous (60%), enterococcus faecalis (5%), enterococcus duran (5%), enterococcus spp. (30%). also, the metagenomic analysis showed that enterococcal community of cheese include enterococcus malodoratous (72%), enterococcus faecalis (6%), enterococcus italicus (13%), enterococcus spp. (10%) and its microbiome is resistance to ‌antibiotics ‌and bacteriophages and has the production potential of antioxidant compounds and antimicrobial compounds such as plantaricin. moreover, laboratory tests confirmed ‌‌antibiotics resistance and antimicrobial properties of isolates. conclusion: this study showed that some local cheeses can be responsible for transferring antibioticresistant genes to humans and consumption of these cheeses should be limited.