بیان پروتئین انسولین گیاهی در مخمر پروبیوتیک saccharomyces boulardii

سابقه و هدف: دیابت نوعی اختلال مزمن در متابولیسم کربوهیدرات، چربی و پروتئین هاست و مشخصه آن افزایش قند خون در بیمار است. نارسایی قلبی عروقی، کلیوی و کاهش فعالیت عصبی از جمله عوارض طولانی مدت این بیماری می باشد. کاربرد داروهای گیاهی برای درمان دیابت، روز به روز بیشتر میشود و این مسئله سبب شده شناخت داروی گیاهی کارآمد اهمیت بیشتری یپیدا کند. داروهای گیاهی به دلیل عوارض کمتر، قیمت مناسب و دردسترس بودن نسبت به داروهای شیمیایی مورد توجه قرارگرفته است. یکی از گیاهان موثر، خربزه تلخ یا کارلا با نام علمی momordica charantia یک گیاه دارویی متعلق به خانواده کدوئیان (cucurbitacea) است که به دلیل دارا بودن ترکیباتی از جمله پلی پپتیدی به نام پلی پپتید p یا p انسولین در درمان دیابت موثر می باشد. p– انسولین متشکل از 172 اسید آمینه است و مقدارش در گیاه بسیار کم است. کلون کردن ژن p انسولین و بیان بالای آن در میکروارگانیسم، راه حلی سریع و مفید برای حل این مشکل است. استفاده از مخمر پروبیوتیک این مزیت را دارد که پس از تولید پروتئین هدف نیاز به خالص سازی آن نیست در صورتیکه تولید پروتئین نوترکیب در سایر میزبان های بیانی مستلزم خالص سازی آن جهت مصرف می باشد. بدین منظور در این تحقیق توالی ژن p انسولین پس از بهینه سازی از لحاظ توالی در میزبان مخمر پروبیوتیکی saccharomyces boulardii بیان شد. مواد و روش ها: در این تحقیق بهینه سازی توالی ژن p انسولین جهت بیان در مخمر پروبیوتیک s. boulardii به دو طریق بهینه سازی کدونی و بهینه سازی ساختار ثانویه mrna انجام گردید. توالی ژن بهینه سازی شده در وکتور بیانی pesc تحت پروموتر القایی gal10 کلون و به سلول مستعد s. boulardii ترانسفورم شد. از مخمر نوترکیب استخراج dna و در ادامه با آغازگرهای اختصاصی ژن p انسولین واکنش pcr انجام گرفت. مخمر نوترکیب توسط گالاکتوز القاء و تولید پروتئین p– انسولین در سیتوپلاسم مخمر نوترکیب از طریق sdspage و طیف سنجی جرمی تائید گردید. یافته ها: واکنش زنجیره ای پلی مراز با آغازگرهای اختصاصی ژن p انسولین قطعه 350 جفت بازی را از وکتور بیانی نوترکیب تکثیر کرد که نشان از کلونینگ موفق ژن مذکور بود. الگوی الکتروفورز sds-page برای s. boulardii میزبان و s. boulardii ترانسفورم شده با ناقل pesc/pinsulin مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج الکتروفورز پروتئین نشان داد که باند پروتئین p– انسولین با وزن مولکولی 18.5 kd و بصورت افتراقی فقط در مخمر نوترکیب بیان گردید. همچنین نتایج طیف سنجی جرمی تایید کرد که باند افتراقی مربوط به پروتئین p– انسولین می باشد. نتیجه گیری: در این تحقیق برای اولین بار از مخمر پروبیوتیک s. boulardii به عنوان میزبان موفق برای تولید پروتئین p– انسولین استفاده گردید. نتایج این تحقیق نشان داد که از مخمر پروبیوتیک s. boulardii می توان به عنوان میزبان مناسب برای تولید سایر محصولات در صنایع غذایی و دارویی استفاده کرد.

Expression of plant insulin in probiotic yeast Saccharomyces boulardii

Abstract: Background and objectives: Diabetes mellitus is a chronic disorder in carbohydrate, fat and protein metabolism. Its characteristic is an increase in blood sugar in the patient. The longterm complications of this disease is cardiovascular, renal failure and neurological activity. The use of herbal medicines for the treatment of diabetes is increasing day by day and this has made it more important to recognize the effective herbal medicine. Herbal remedies have been taken into consideration because of fewer complications, reasonable prices, and availability of chemical drugs. The Momordica charantia (Linn Family: Cucurbaceae), whose fruit is known as Karela or bittergourd, is an important antidiabetic plant. One of the antidiabetic agents of Karela is PolypeptidP (p insulin), a 172 amino acid. The content of polypeptideP in cultivated plants is relatively low so gene cloning and expression of this polypeptide in microorganism is a quick and useful alternative for solving such problem. The probiotic host has the advantage that after the production of target protein, it is not necessary to purify it but producing recombinant protein in other expression hosts need to be purified. Therefore, in this study p insulin gene was optimized and expressed in probiotic yeast Saccharomyces boulardii. Material and method: In this research, the sequence of p insulin gene was optimized for both codon bias and secondary structure of mRNA to effectively express in the probiotic yeast Saccharomyces boulardii. The optimized gene was cloned into the pESC expression vector under Gal10 promoter and transformed to competent cell. Recombinant yeast was extracted DNA then the PCR reaction was done by p insulin specific primers. Recombinant yeast was induced by galactose and production of Pinsulin protein in the recombinant yeast cytoplasm was verified by SDSPAGE and mass spectrometry. Results: A 350 base pair production was amplified by pinsulin specific primers in the polymerase chain reaction. SDSPAGE electrophoresis pattern was compared host S. boulardii and transformed S. boulardii carrying pESC/pinsulin construct. Electrophoresis results showed that the 18.5 KD molecular weight p insulin protein differential band was expressed just in the recombinant yeast and also mass spectrometry results confirmed differential band as a p insulin protein. Conclusion: In this study, probiotic yeast Saccharomyces boulardii was used as a successful host to producing p insulin protein for the first time. This research showed that probiotic yeast S. boulardii can used as a suitable host cell to producing other products in the food and pharmaceutical industries.