تاثیر عناصر ترانسپوزونی بر بهبود بیان پروتئین نوترکیب اریتروپوئتین در سلول ‌های تخمدان همستر چینی

در صنعت زیست داروها و تولید پروتئین های نوترکیب به دلیل بازده پایین درج ژن هدف در ژنوم سلول میزبان و همچنین ادغام در مناطق هتروکروماتین که منجر به سرکوب رونویسی و ناپایداری بیان توالی مورد نظر می گردد، دستیابی به سلول های دارای بیان بالا با چالش رو برو است. به منظور غلبه بر این محدودیت ها، می توان از ترانسپوزون ها که عناصر ژنتیکی متحرک بوده و با مکانیسم cut and paste توانایی برش و درج قطعات هدف در نواحی خاصی از ژنوم را دارا می باشند، استفاده کرد. هدف از این پژوهش بررسی تاثیر عنصر ترانسپوزونی piggybac بر میزان بیان پروتئین نوترکیب اریتروپوئتین و دست پیدا کردن به رده ی سلولی دارای بیان بالا دست می باشد. ابتدا توالی ژن اریتروپوئتین نوترکیب (repo) بهینه شده بر اساس ارجحیت کدونی سلول cho در وکتور poptivectm همسانه سازی شد. جهت ایجاد دومین وکتور بیانی، قطعه ی epo-ires-dhfr در پلاسمید pb513b-1 درج و سپس مراحل همسانه سازی در هر دو ناقل با استفاده از واکنش colony pcr، هضم آنزیمی و توالی یابی سنگر تایید شد. جهت ایجاد لاین سلولی پایدار، هر دو وکتور به طور مجزا به سلول cho dg44 ترانسفکت و سپس غربالگری آن ها انجام شد. پس از تایید درج وکتورها درون ژنوم سلول هدف، میزان بیان ژن اریتروپوئتین در سطح رونوشت و پروتئین به ترتیب با استفاده از تست های qrt-pcr و وسترن بلاتینگ در دو رده ی سلولی بررسی شد. نتایج حاصل از آزمایش real-time pcr، افزایش 188 برابری میزان رونوشت ژن اریتروپوئتین در لاین سلولی pb513b-1-epo نسبت به poptivec-epo را نشان داد. همچنین یافته های آزمایش وسترن بلاتینگ، سنتز و ترشح صحیح این پروتئین را تایید کرد. بررسی نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که عنصر ترانسپوزونی به صورت چشمگیری سبب افزایش بیان ژن موردنظر در سطح رونوشت شده و توانایی ایجاد رده ی سلولی با بیان بالا از پروتئین هدف را دارا است.

utilizing the transposon vector to enhance the expression of recombinant erythropoietin in chinese hamster ovary cells

in pharmaceutical biotechnology and recombinant protein production, due to the low efficacy of inserting the target gene into the host gene genome and its integration into the heterochromatin regions, which leads to the suppression of transcription as well as the instability of the expression of the desired sequence, achieving cells with highexpression is a challenge. to overcome the limitations transposons, which are mobile genetic elements and have the ability to cut and insert target fragments in certain regions of the genome with the “cut and paste” mechanism, are effective. this research aims to evaluate the effect of the piggybac transposon vector on the expression level of recombinant erythropoietin (repo) protein and to find a cell line with high expression. first the optimized repo sequence based on cho codon performance was cloned into the poptivectm plasmid. to create the second expression vector, the epo-ires-dhfr fragment was inserted into the pb513b-1 plasmid, and then the homogenization steps in both vectors were confirmed using colony pcr reaction, enzyme digestion, and sanger sequencing. in order to create a stable cell line, both vectors were separately transfected into cho dg44 cells and then screened. after confirming the insertion of the vectors into the genome of the target cell, the level of erythropoietin gene expression at the transcript and protein level was checked using qrt-pcr and western blotting tests, respectively, in two cell lines. the real-time pcr data indicate a 188-fold increase in erythropoietin gene transcript in the pb513b-1-epo cell line compared to poptivec-epo. additionally, the western blotting test's result confirmed the correct synthesis and secretion of this protein. analysis of findings in this research revealed that the transposon element significantly increased the expression of the desired gene at the transcriptional level and had could create a cell line with high expression of the target protein.