جداسازی، کشت و شناسایی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان سگ

هدف از این مطالعه جداسازی، تکثیر و شناسایی سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان سگ بود. بدین منظور نمونه خون مغز استخوان 15 قلاده سگ نر بالغ جمع آوری گردید و پس از سانتریفیوژ، سلول های تک هسته ای جدا شده در محیط استاندارد کشت داده شدند. سلول های چسبنده به محیط کشت جدا گردیده و پس از سه بار پاساژ ماهیت مزانشیمی آنها با استفاده از مرفولوژی سلولی، ارزیابی آنتی ژن های سطحی و تمایز به رده سلول های استخوانی و چربی مورد تایید قرار گرفت. پس از 4 روز کشت، سلول های دوکی شکل شبیه فیبروبلاست یا همان سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان ظاهر گردید و با گذشت زمان بر تعداد آنها افزوده شد و تراکم سلولی افزایش پیدا کرد. میانگین مدت زمانی که طول کشید تا سلول ها به تراکم بیش از 75 درصد در پاساژ سوم برسند، برابر با 75/5±89/22 روز بود. نتایج آنالیز فلوسیتومتری نشان داد که این سلول ها از نظر بیان شاخص های cd34 و cd45 منفی بوده و در مقابل بیان شاخص های cd44 و cd105 آنها مثبت بود. کشت در محیط های القایی استئوسیتی و آدیپوسیتی به مدت یک ماه منجر به تبدیل شدن این سلول ها به رده های سلولی استخوانی و چربی گشت که نشانگر قدرت تمایز این سلول ها می باشد. افزایش بیان ژن های vdr، col1a1، bglap و sparc نشانگر تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی جداشده از مغز استخوان سگ به سلول های استخوانی در محیط کشت القایی می باشد. این یافته ها می تواند مبنایی برای انجام مطالعات بالینی آتی به ویژه در ارتباط با نوزایش بافت های استخوانی و غضروفی با استفاده از سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان سگ باشد.

Isolation, culture expansion and characterization of canine bone marrow derived mesenchymal stem cells

The purpose of the present study was to isolate, culture expand and characterize canine bone marrow derived mesenchymal stem cells. Bone marrow aspirates of 15 adult male dogs were collected to this end and their mononuclear cells isolated by centrifugation and cultured in standard media. The adherent cells were isolated and their mesenchymal origin was confirmed at 3rd passage by cellular morphology, expression of surface antigens and differentiation to osteogenic and adipogenic lineage. After 4 days, spindle shaped fibroblast like cells which were apparently bone marrow derived mesenchymal stem cells appeared in culture medium and their numbers increased over time. The cells reached 3rd passage with over 75% confluent after a mean of 22.89±5.75 days. Flow cytometric analysis revealed that the cells negatively expressed CD34 and CD45 antigens while positively expressing CD44 and CD105 antigens. Differentiation into osteogenic and adipogenic lineage had taken place after one month culture in induction medium. VDR, COL1A1, BGLAP and SPARC gene expression indicated that mesenchymal stem cells isolated from canine bone marrow had differentiated into osteogenic lineage. These findings can form the basis of any forthcoming clinical studies involving the use of canine mesenchymal stem cells particularly in the field of bone and cartilage regeneration.