the identification of single strand dna aptamers which specifically bind to platelets using cell-selex technique

Aptamers are oligonucleotides that can be easily synthesized and bind to their targets with high affinity and specificity. several aptamers specific to soluble factors of coagulation cascade have been produced, however, aptamers specific to platelet cell membrane molecules have not been reported yet. we aimed to discover dna aptamers that specifically bind to human platelets. the cell-selex method was used for aptamer discovery. synthetic 79 nucleotides length single-strand oligonucleotides were used as a library. ultra-pure platelets were prepared using differential centrifugation steps and magnetic-bead-assisted removal of contaminating cells. the fitc-labeled forward primer was used for amplification of the selected oligonucleotides by pcr, and lambda exonuclease was used for digestion of the lagging strand. after 12 rounds of cell-selex, selected oligos were amplified and cloned to ptg19-t vector, transfected into e. coli (top10) and sequenced. sequences of aptamers from 200 individual positive colonies were aligned and seven clusters were identified. representative aptamers were amplified and their affinity, specificity, and digestibility of their targets were evaluated. interferences of the aptamers to two platelet function tests were also investigated. affinity (kd) of the representative aptamers were between 109 and 340 nm. trypsin exposure of the platelets completely abolished the binding of the 7 aptamers to the targets. the binding of the four aptamers fully protected their target molecules from digestion. no one of the aptamers changed the parameters of the platelet function tests. seven aptamers specific to platelets were identified and characterized. these aptamers may have potentially diverse applications in the diagnosis or treatment of platelet disorders.

شناسایی آپتامرهای تک رشته از جنس DNA که به طور اختصاصی به پلاکت ها متصل میشوند با استفاده از تکنیک Cell-SELEX

آپتامرها اولیگونوکلئوتیدهایی هستند که به آسانی تولید میشوند و با گرایش و اختصاصیت فوق العاده به اهداف خود متصل میشوند. چندین آپتامر ویژه عوامل محلول آبشار انعقادی تولید شده اند اما آپتامرهای ویژه مولکول های سطحی پلاکت، تا به حال تولید نشده اند. هدف ما کشف آپتامرهایی از جنس DNA می‌باشد که می‌توانند به طور اختصاصی به پلاکت های انسانی  متصل شوند. از روش cellSELEX  برای کشف آپتامرها استفاده گردید. اولیگونوکلئوتیدهای تک رشته سنتز شده با طول 79 نوکلئوتید به عنوان مخزن اولیه آپتامر استفاده گردید. پلاکت های خالص از طریق حذف ناخالصی ها با استفاده از سانتریفیوژ افتراقی و دانه های مغناطیسی تهیه گردید. پرایمر فوروارد نشاندار شده با FITC برای تکثیر اولیگونوکلئوتیدهای انتخاب شده به روش PCR استفاده گردید و از آنزیم اگزونوکلئاز برای حذف رشته پیرو استفاده شد. پس از انجام 12 مرحله cellSELEX اولیگونوکلئوتیدهای انتخاب شده تکثیر شده و به وکتور مناسب کلون گردید و پس از تکثیر در باکتری مناسب توالی آنها تعیین گردید. توالی آپتامرهای حاصل از 200 کلنی مثبت، هم تراز شده و وجود هفت گروه آپتامری شناسایی گردید. آپتامرهای خالص انتخاب شده از هر گروه، تکثیر شده و شدت و ویژگی گرایش آنها به هدف و نیز هضم پذیری مولکول های هدف آنها ارزیابی شد. تداخل این آپتامرها با دو تست عملکردی پلاکت ها نیز تحقیق شد. میل ترکیبی آپتامرهای شناسایی شده از 109 تا 340 نانو مولار بود. قرار گرفتن پلاکت ها در معرض تریپسین اتصال بعدی همه هفت آپتامر شاخص را به مولکول های هدف خود ملغا نمود. چهار تا از آپتامرها پس از اتصال به هدف، از مولکول هدف خود در مقابل آنزیم تریپسین محافظت نمودند. هیچ یک از هفت آپتامر تاثیر معنی داری بر نتایج تست های عملکردی پلاکت نداشتند. در این تحقیق هفت آپتامر ویژه پلاکت ها شناسایی و خصوصیات آنها تعیین شد. این آپتامرها ممکن است کاربردهای متنوعی در تشخیص و یا درمان اختلالات پلاکتی داشته باشند.