تشخیص مولکولی و تعیین توالی اسیدهای آمینه ناحیه شکافتگی هماگلوتینین در ویروس آنفلوانزای جداشده از طیور گوشتی استان خراسان شمالی

بیماری آنفلوانزای پرندگان یکی از بیماری های ویروسی مهم در مرغداری های صنعتی کشور می باشد و هر سال خسارات عمده ای به صنعت پرورش طیور کشور وارد می‌کند.تشخیص سریع ویروس آنفلوانزا و تعیین حدت آنها یکی از اولویت های مهم پیشگیری و مبارزه علیه این بیماری در کشور محسوب می شود. از آزمایش rt-pcr جهت تشخیص ویروس های آنفلوانزا و نیز بررسی تواالی محل شکافتگی پروتیین هماگلوتینین (ha) به عنوان یک شاخص مولکولی به منظور پیش بینی حدت سویه های آنفلوانزا مورد استفاده قرار گرفت. در این تحقیق جهت پایش بیماری آنفلوانزا 160 نمونه سوآپ نای از 20 واحد پرورش مرغ گوشتی در استان خراسان شمالی که مشکوک به بیماری آنفلوانزا بودند اخذگردید. آزمایش مولکولی rt-pcr براساس ژنوتیپ های شایع در ایران پایه ریزی گردید که در آن برای تعیین تیپ گروه a آنفلوانزا از پرایمراختصاصی ژن ماتریکس (m)وجهت تعیین تحت تیپ های h9، h5 ، h7 از پرایمرهای اختصاصی ژن هماگلوتنین(ha) استفاده شد. جهت تعیین توالی، نمونه های مثبت شده از نظر تیپ aبه تخم مرغ جنین دار (spf) 9-11 روزه تزریق شد، پس از سه تاپنج روز مایع آلانتوییک با استفاده از فرمالین 1درصد خنثی و جهت بررسی تست هماگلوتیناسیون و استخراج rnaی ویروسی استفاده گردید. سپس قطعه ای به طول 437bp دربرگیرنده محل شکافتگی ژن هماگلوتینین تکثیر و جهت تعیین توالی نوکلیوتیدی به شرکت mwgآلمان ارسال شد و درنهایت به توالی اسیدآمینه ای ترجمه گردید .نتایج نشان دادکه با استفاده ازروش rt-pcr نمونه های اخذشده از 4 مرغداری صنعتی از نظر ویروس تیپ a آنفلوانزا مثبت بودند. تمام ویروس های تیپ aاز نظر تحت تیپ h5 ، h7 ، منفی و از لحاظ h9 مثبت تشخیص داده شدند. بررسی محل شکافتگی پروتیین هماگلوتینین نشان دادکه هر4 سویه دارای توالی kssr بودند، اگرچه این توالی نشان دهنده غیرحاد بودن سویه ها می باشد ولی با الگوی جدایه های قبلی ایران که عمدتا rssr می‌باشد تفاوت داشت. به طورکلی آزمایش rt-pcr با استفاده ازپرایمرهای اختصاصی تحت تیپ های رایج درمنطقه، تشخیص تفریقی سریع ویروس‌های آنفلوانزا را امکان پذیرمی سازد. تغییر در محل شکافت پروتیین هماگلوتینین درویروس های h9n2 را می‌توان به عنوان یک خطر بالقوه جهت تبدیل این ویروس ها به سویه های حاد در نظرگرفت .لذا پایش مستمر توالی ژنتیکی این ویروس ها توصیه می گردد.