بررسی کمی تاثیر سورفاکتانت‌ها و عوامل کائوتروپ بر فعالیت آسکوربات پراکسیداز در توت فرنگی و توت سیاه

سابقه و هدف:سابقه و هدف: در میان آلاینده های مختلف، سورفاکتانت ها و عوامل کائوتروپ، خطرات جدی برای اکوسیستم های طبیعی دارند. علاوه بر آن، اجزای سورفاکتانت ها و عوامل کائوتروپ می توانند از منابع مختلف به خاک و آب وارد شوند و بر روی جانوران و گیاهان اثرگذار باشند.هدف از این پژوهش بررسی تنش حاصله از سورفاکتانتها و عوامل کائوتروپ بر روی آسکوربات پراکسیداز (apx) به عنوان یکی از آنزیم‌های آنتی‌اکسیداتیو نقش مهمی در سیستم دفاعی گیاهان در برابر تنش‌های محیطی دارد و در تنظیم غلظت هیدروژن پراکسید(h2o2) در سلول‌های گیاهی موثر بوده و پراکسیدهیدروژن را در جهت ممانعت از آسیب و صدمات گیاهی تجزیه می‌کند. هنگام تنش‌های مختلف محیطی، آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مثل آسکوربات‌ پراکسیداز در بخش‌های مختلف گیاهی همچون میوه افزایش می‌یابند. البته میزان سنتز زیستی این آنزیم‌ ضداکسیدانی به شدت و مدت زمان تنش موجود در گیاه وابسته است. با توجه به اهمیت وجود این آنزیم در ساختارهای گیاهی، این مطالعه به منظور بررسی بیشینه فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در سطوح مختلف سورفکتانتها و عوامل کائوتروپ باجرا در آمد.مواد و روشها: این پژوهش در آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاه پیام نور کردستان بر روی توت فرنگی و توت سیاه باجرا در آمد. به منظور تهیه عصاره از میوه های تهیه شده، از بافر سیترات-فسفات 0.1 مولار با 7 ph و محلول 0.02 فنیل متان سولفونیل فلوراید به عنوان مهارکننده پروتئازی هموژنیزه استفاده گردید. برای بررسی اثر سورفاکتانهای مختلف یونی و غیر یونی و نیز عوامل کائوتروپ از غلظتهای 0 تا یک سدیم دودسیل سولفات ((sds (سورفاکتانت یونی)، 0 تا 30 سدیم‌کولات (سورفاکتانت یونی)، 0 تا 0.3 سارکوزیل (سورفاکتانت یونی)، 0 تا 0.07 توین 20 و توین 80 (سورفاکتانت غیریونی) و 0 تا 30 اوره و گوانیدین هیدروکلرید (عوامل کائوتروپیک) استفاده شد و فعالیت st.apx و bm.apx مورد سنجش قرار گرفت. همچنین در حضور غلظتهای ثابت آسکوربات و h2o2 ، نوع مهار apx بوسیله کوجیک اسید تعیین گردید. برای تعیین بهترین سطح پاسخ آنزیم آسکوربات پراکسیداز به سطوح مختلف تیمارهای مورد مطالعه با توجه به کمی بودن تیمارها از تجزیه رگرسیون خطی و غیرخطی بهره گرفته شد. برای برازش مدلهای رگرسیون غیرخطی و از رویه proc nlin در محیط نرم افزار (sas) از روش مطلوب سازی تکراری و نرم افزار graphpadprismبهره گرفته شد. یافته‌ها: نتایج نشان داد که در عصاره‌های تهیه شده از توت فرنگی و توت سیاه، اسیدیته بهینه 6.7 بود و بازده کاتالیکی نیز در توت سیاه 1.6 برابر بیشتر از توت فرنگی بود. توت فرنگی(st.apx) و توت سیاه(bm.apx) اسیدیته بهینه 6.7 و بازدهی کاتالیتیکی، در مورد bm.apx حدود 1.6 برابر بالاتر از st.apx به دست آمد. با افزایش غلظت آسکوربات در غلظت ثابت h2o2 فعالیت bm.apx و st.apx با افزایش همراه شد، طوری که بالاترین میزان فعالیت آنزیم برای هر دو گیاه bm.apx در غلظت 0.5 واحد بر میلی‌گرم پروتئین حاصل شد. نتایج همچنین نشان داد که فعالیت st.apx و bm.apx بوسیله کوجیک اسید مهار شده و در هر دو از نوع غیررقابتی بود. از میان عوامل کائوتروپ و سورفاکتانت‌های مورد استفاده تنها sds فعالیت st.apx و bm.apx را فعال نمودو بیشینه تاثیر آن در غلظت 0.2 میلی مولار اتفاق افتاد. از طرف دیگر در سایر عوامل، میزان مهارشوندگی و کاهش فعالیت bm.apx نسبت به st.apx بیشتر بوده و باستثنای پاسخ آسکوربات پرکسیداز به کوجیک اسید و سدیم کالات د رتوت فرنگی در مورد سایر عوامل پاسخ آنزیم از تابع نمائی کاهشی تک فازی پیروی کرد.نتیجه گیری: دراین تحقیق آسکوربات پراکسیداز با تبعیت از سینتیک میکائیلیس منتن و نیز با اتصال سوبسترا به جایگاه فعال آنزیمی، فرم فعالتری به خود گرفته و با انجام کاتالیز آنزیمی موجب مصرف آسکوربات در توت فرنگی و توت سیاه می‌گردد. سورفاکتانت‌های یونی با مکانیزم فعال‌کنندگی همچون sds و مکانیزم مهارکنندگی همچون سارکوزیل و سدیم کولات اثرات متفاوتی بر روی آسکوربات پراکسیداز اعمال نموده که این آنزیم علی رغم حساسیت بالاتر در توت سیاه دارای سرعت فعالیت بیشتری نسبت به پراکسیداز موجود در توت فرنگی بود. سورفاکتانت‌های غیریونی نیز مانند عامل کائوتروپ کوجیک اسید از طریق مهارکنندگی باعث کاهش فعالیت آسکوربات پراکسیداز در هر دو گونه گیاهی شد.

quantitative investigation of the effect of surfactants and chaotropes on ascorbate peroxidase activity in strawberry and blackberry

background and purpose: as one of the antioxidant enzymes, ascorbate peroxidase (apx) has an important role in the defense system of plants against environmental stresses and is effective in regulating the concentration of hydrogen peroxide (h2o2) in plant cells. apx decomposes hydrogen peroxide in order to prevent plant damage. during various environmental stresses, antioxidant enzymes such as apx increase in different plant parts such as fruit. of course, the rate of biosynthesis of this antioxidant enzyme depends on the intensity and duration of stress in the plant. considering the importance of the presence of this enzyme in plant structures, this study was conducted to investigate the maximum activity of ascorbate peroxidase enzyme at different levels of surfactants and chaotropes.materials and methods: this research was carried out in the research laboratory of payam noor university of kurdistan. in order to prepare the extract from strawberries and blackberries, in the presence of 0.1 m citrate-phosphate buffer with ph 7 and 0.02 phenylmethanesulfonylfluoride solution as a protease inhibitor, the fruits were homogenized separately. results: based on the results of this research, for the ascorbate substrate used in the apx measurement in the extracts prepared from strawberry (st.apx) and blackberry (bm.apx), the optimal ph is 6.7 and the catalytic efficiency of bm.apx, is about 1.6 times higher than st.apx was obtained. with the increase of ascorbate concentration in constant concentration of h2o2, the activity of bm.apx and st.apx increases, so that the highest level of activity of both plant 0. 5 units per mg of protein. a further increase in substrate concentration was associated with substrate inhibition of bm.apx and st.apx. the activity curve of apx in both plant species is hyperbolic, which follows the michaelis-menten kinetics, which indicates the high tendency of the enzyme to consume ascorbate. the activity of st.apx and bm.apx is inhibited by kojic acid and it is non-competitive in both. among the used chaotropes and surfactants, only sds activated the activity of st.apx and bm.apx, and the activities of st.apx and bm.apx showed different sensitivities to the surfactants, chaotropes and kojic acid. despite the fact that bm.apx showed higher activity than st.apx in the presence of ascorbate and sds, in the presence of other factors, the rate of inhibition of bm.apx was higher than st.apx and showed higher percentages of inhibition. urea and guanidine hydrochloride as reducing agents showed an inhibitory role on st.apx and bm.apx. the activity of apx the results also showed that the activity of st.apx and bm.apx was inhibited by kojic acid and it was non-competitive in both. among the chaotropes and surfactants used, only sds activated the activity of st.apx and bm.apx and its maximum effect occurred at a concentration of 0.2 mm. on the other hand, in other factors, the rate of inhibition and reduction of bm.apx activity was higher than st.apx, and with the exception of ascorbate peroxidase response to kojic acid and sodium calate in strawberry, the enzyme response followed a monophasic decreasing exponentialconclusion: in this research, ascorbate peroxidase takes a more active form by following michaelis menten’s kinetics and binding the substrate to the active site of the enzyme, and by performing enzyme catalysis, it causes ascorbate consumption in strawberries and blackberries. ionic surfactants with an activation mechanism such as sds and an inhibitory mechanism such as sarkosyl and sodium cholate have different effects on ascorbate peroxidase. non-ionic surfactants such as kojic acid and chaotrope agents reduce the activity of ascorbate peroxidase in both plant species. the position of kojic acid is different from the position of ascorbate due to the non-competitive type of inhibition.