همسانه‌سازی، توالی‌یابی و بررسی بیان ژن c4h در آنغوزه تلخ ferula pseudalliacea

سابقه و هدف: آنغوزه تلخ ferula pseudalliacea گیاهی از خانواده چتریان، چند ساله و مونوکارپیک می‌باشد. رویشگاه این گیاه آسیای مرکزی تا نوار شمالی اروپا می‌باشد. ترکیبات اصلی تشکیل دهنده متابولیت‌های ثانویه این جنس شامل کومارین‌ها، سزکوئی‌ترپن‌ کومارین‌ها و دی‌سزکوئی‌ترپن‌کومارین‌ها می‌باشد. با توجه به ترکیبات موجود در این گیاه از گذشته‌های دور توسط مردم بومی در طب سنتی به صورت گسترده استفاده شده است. مسیر اصلی بیوسنتز ترکیبات موثر این گیاه مسیر فنیل‌پروپانوئید است. یکی از آنزیم‌‌های اصلی و کلیدی این مسیر سینامات -4- هیدروکسی لیاز است. هیچ اطلاعات ژنومی از ژن‌های این گیاه دارویی با ارزش وجود ندارد و به‌عنوان اولین گزارش ، ژن c4h از این گیاه همسانه و توالی‌یابی شد و میزان بیان آن در ریشه، ساقه، برگ، گل آذین و بذر نارس مورد بررسی قرار گرفت.مواد و روش‌ها: قسمت‌های مختلف گیاه ferula pseudalliacea در اوایل خردادماه از جنوب شرقی روستای گزنه در 20 کیلومتری سنندج جمع‎‌آوری گردید. استخراج rna از بافت های مختلف گیاه ferula pseudalliacea با روش لیتیم کلرید انجام گرفت. جهت سنتز cdna ، از کیت سنتز cdna شرکت یکتا تجهیز در حجم 20 میکرولیتر استفاده شد. محصول پی سی آر با استفاده از آغازگر طراحی شده از نواحی حفاظت شده ژن c4h، درون ناقل ptg19 همسانه شد. نمونه‌های پلاسمید نوترکیب بعد از تایید مولکولی ، جهت تعیین توالی به شرکت آپلاید بیوسیستم ارسال شد. جهت ارزیابی میزان بیان ژن‌ c4h از دو روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی و روش نیمه کمی استفاده شد. دندروگرام داده‌های به دست آمده از توالی‌یابی هر ژن، با استفاده از نرم‌افزار مگا با روش آماری اتصال همسایگی با میزان بوت سترپ برای توالی پروتئینی رسم شد.یافته‌ها: توالی‌های به دست آمده از کلون‌های ژن c4h در پایگاه داده ان سی بی آی با استفاده از blastx همردیف شد و با توجه به نتیجه بلاست، توالی های دو ژن ذکر شده تایید گردید. این ژن با ژن‌های c4h سایر گیاهان هم خانواده خود در یک گروه قرار گرفت. این ژن بالاترین تشابه را در هر دو سطح توالی نوکلئوتیدی و پروتئین با ژن c4h هویج نشان داد که با هم در یک زیر گروه قرار گرفتند. ژن c4h دارای 7 موتیف بوده که موتیف حفظ شده سیتوکروم سیستئین p450 با توالی fgvgrrscpg در خانواده سیتوکروم p450 جز آنها می‌باشد. بررسی بیان ژن با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی بالاترین سطح رونویسی را در گل‌آذین و کمترین میزان بیان را در برگ نشان داد.نتیجه‌گیری: c4h به عنوان دومین ژن کلیدی مسیر فنیل‌پروپانوئید نقش انکارناپذیر در تولید ترکیبات فنلی در بافت‌های ویژه همانند گل‌آذین که بیشترین میزان بیان را نشان داد، دارد. سایر پژوهش‌های انجام شده درگیاهان مختلف در زمینه بیان ژن c4h نشان از اختصاصی عمل کردن در تولید ترکیب‌های خاص، در بافت خاصی بوده است. با توجه به اینکه ترکیبات فنلی دامنه وسیعی از متابولیت‎های ثانویه را به صورت مواد فرار (اسانس) و عصاره شامل می‌شود برای پی بردن به نقش دقیق آنزیم c4h در اندام‌های مختلف نیاز به تحقیق بیشتر می‌باشد. با توجه به نقش انکارناپذیر ژن c4h در بیوسنتز بسیار از ترکیبات با ارزش دارویی، از توالی شناسایی شده می‌توان در تولید ترکیبات نوترکیب در سایر گونه‌های گیاهی که پیش‌ماده‌های مورد نظر را دارند، استفاده نمود.

cloning, sequencing and expression analysis of c4h gene in ferula pseudalliacea

background and objectives: ferula pseudalliacea is a perennial and monocarpic plant species belonging to apiaceae family. this species is distributed from middle asia to northern europe. the main secondary metabolites present in ferula genus comprise coumarins, sesquiterpene coumarins and disesquiterpene coumarins. based on phytochemicals present in this plant species, it has been extensively utilized by local people in traditional medicine for long time. phenylpropanoid pathway is mainly responsible for biosynthesis of these valuable phytochemicals. cynamate4hydrolxylase (c4h) is one of the main and key enzyme in phenylpropanoid pathway. to date, there is no genomic or transcriptomic information in ferula pseudalliacea and as the first report, we aimed to clone and sequence c4h and its expression analysis in root, stem, leaf, inflorescence and immature seed in this valuable medicinal plant species. materials and methods: different organs of f. pseudalliacea were collected from gazne village near sanandaj city in june 2019. rna was extracted from collected organs using licl method. cdna was synthesized using yekta tajihz azmia kit in 20 µl reactions. pcr products amplified with primer designed from conserved regions of c4h among apiaceous species and it was then cloned within ptg19. the verified recombinant plasmid were send for applied biosystem company for sequencing. to confirm and asses the expression of c4h, both realtime pcr and semiquantitative pcr were employed. the phylogenetic tree of c4h was obtained using omega software based on the neighborjoining method with bootstrap 1000 for amino acid sequence. results: the obtained sequences from c4h clones was aligned and verified using blastx. in the resulted dendrogram, c4h sequence from f. pseudalliacea was grouped with c4h gene from other species within apiaceae family showing their clos relationship. the highest sequence identity was observed with c4h from daucus carota which was fallen in same cluster with c4h from f. pseudalliacea. it is shown that c4h has 7 motifs one of this motifs belongs to conserved motif cytochromecysteine 450 with fgvgrrscpg sequence. conclusion: as the seconf most important gene in phenylpropanoid biosynthetic pathway, c4h plays an undeniable role in production of phenolic phytochemicals in particular in inflorescence which had the highest c4h expression rate. studies performed on the c4h expression in other species revealed a specific action of c4h in biosynthesis of special secondary metabolites in specific tissue. as the phenolic compounds encompass a diverse range of secondary metabolites in forms of volatile and extracts, further investigations are needed to understand the exact role of c4h enzyme. moreover, the identified gene sequence can be sued in production of recombinant constituents in other species which have the corresponding precursors.