مطالعه فیلوژنی مولکولی و ساختار پروتئین matk در سوسن چلچراغ (lilium ledebourii [baker] boiss)

سابقه و هدف: ژن کلروپلاستی matk یکی از بهترین ژن‌های بارکد گیاهی است و از مناسبترین ژن‌ها برای بررسی روابط فیلوژنتیکی و تکاملی در سطوح گونه تا خانواده معرفی شده است. جنس لیلیوم مهمترین جنس خانواده لیلیاسه با تقریباً 100 گونه است که چندین بار مورد طبقه‌بندی قرار گرفته است. طبقه‌بندی این خانواده همواره با مطالعات مورفولوژیکی، کاریولوژیکی و فیلوژنی پیگیری می‌شود. رویکردهای جدید فیلوژنی مولکولی باعث تغییراتی اساسی در این طبقه‌بندی شده است. سوسن چلچراغ از گونه‌های ارزشمند بومی ایران است که به شدت در معرض خطر انقراض قرار دارد. این گونه علی‌رغم ویژگی‌های ارزشمندی که دارد، تاکنون در هیچ مطالعه‌ای با سایر گونه‌های این خانواده از نظر جایگاه فیلوژنی مورد بررسی قرار نگرفته است. این پژوهش با بکارگیری توالی matk به بررسی جایگاه رده‌بندی و قرابت ژنتیکی سوسن چلچراغ با 41 گونه دیگر از این جنس پرداخته است.مواد و روش‌ها: استخراج dna با استفاده از کیت qiagen dneasy انجام شد. بعد از تایید کیفیت و کمیت dna، توالی‌یابی بصورت realtime (smrt) با استفاده از پلتفرم نسل جدید pacbio انجام و توالی کامل ژن matk با استفاده از ابزراهای بیوانفورماتیک استخراج و در پایگاه اطلاعات ژنی ncbi به شماره دسترسی mn557236 ثبت شد. به‌منطور بررسی روابط فیلوژنتیک، توالی‌ matk 41 گونه دیگر لیلیوم از پایگاه اطلاعات ژنی بدست آمد. همه توالی‌ها با روش clustalw و با استفاده از نرم‌افزار مگا 7 هم‌ردیف شدند. روش حداکثر درست‌نمایی جهت رسم درخت فیلوژنی بکار گرفته شد. فاصله ژنتیکی به روش k2p محاسبه شد. میزان حداکثر درست‌نمایی مرکب الگوی جایگزینی نوکلئوتیدی با استفاده از ماتریس جایگزینی برآورد شد. با استفاده ابزارهای تخصصیffpred ، interproscan، targetp و phyre2 ساختارهای ثانویهای از قبیل مارپیچ‌های α، پیچ‌های β و مارپیچ‌های تصادفی و ساختار سه بعدی پروتئین مورد بررسی قرار گرفت.یافته‌ها: طبق نتایج درخت فیلوژنی، لیلیوم‌ها به چهار خوشه a، b، c و d تقسیم شدند که گونه ایران در خوشه b قرار گرفت. بر اساس توپولوژی فیلوژنی و همچنین بررسی فاصله ژنتیکی، سوسن چلچراغ بیشترین شباهت را با سه گونه‌ی lilium pyrenaicum ، l. ciliatum و l. candidum با ارزش پایداری 97 % داشت. در بررسی بیوانفورماتیکی، در همردیفی این پروتئین درجه بالایی از حفاظت شدگی مشاهده شد. سوسن چلچراغ در جایگاه 271 دارای اسید آمینه آرژینین هست و از این نظر فقط با سه گونه l. pyrenaicum ، l. ciliatum و l. candidum مشابه بود. سایر گونه‌ها در این جایگاه دارای اسید آمینه لیزین بودند. تفاوت‌های زیادی در جایگاه‌های اسید‌آمینه‌ای مختلف از جمله در موقعیت‌های 317، 346، 363، 417 در گونه‌ها مشاهده شد. بررسی تشابه ساختار دوم توالی matk در سوسن چلچراغ نشان داد که این پروتئین دارای 233 اسیدآمینه در مارپیچ α(51/45 درصد)، 24 اسید آمینه در پیچ β (69/4 درصد) و 156 اسید آمینه در مارپیچ تصادفی (74/30 درصد) است.نتیجه‌گیری: پژوهش حاضر برای اولین بار این ژن را در سوسن چلچراغ مورد تجزیه و تحلیل قرار داد و ساختار دو بعدی و موقعیت α هلیکس‌ها و صفحات β مشخص شد. همچنین مدل ساختار سوم این پروتئین برای نخستین بار ارائه شد. بر اساس توپولوژی فیلوژنی و همچنین بررسی فاصله ژنتیکی، سوسن چلچراغ بیشترین شباهت را با سه گونه‌ی l. pyrenaicum ، l. ciliatum و l. candidum داشت. به طور کلی، در این تحقیق قرابت سوسن چلچراغ از نظر مولکولی (فیلوژنی، ساختار پروتئین) با دیگر گونه‌های لیلیوم بررسی شد.

Study of Molecular phylogenetic and matk protein structure in Susan e Chelcheragh (Lilium ledebourii [Baker] Boiss)

Background and objectives: Chloroplastic matk gene is one of the best genes for a plant barcode and study of phylogenic/evolutionary relationships between plant species and families, possesses a high evolutionary rate at a nucleotide/amino acid level. Lilium, with ~100 species, is the most important genus in the Liliaceae that have been classified. The classification of Liliaceae is continuously studied morphologically, cariologically, and phylogenetically. New molecular phylogenic approaches have lead in fundamental changes in this classification. Lilium ledebourii is a valuable species endemic to Iran, but it is seriously endangered. Notwithstanding its valuable characteristics, Lilium ledebourii has never been phylogenetically studied together with the other members of the Liliaceae. Using matk sequence, we studied the taxonomic position and evolutionary relationships of Lilium ledebourii and 41 other Lilium species.Materials and methods: First, DNA was extracted by using Qiagen DNEasy. After verifying DNA quality and quantity, realtime sequencing (SMRT) was performed using the next generation PacBio platform and a complete matK sequence was obtained using bioinformatics tools. Finally, it was registered in NCBI (ID: MN557236 Pending publishing). For the study of the phylogenetic relationships, matk sequences of the 41 species were downloaded from NCBI. The sequences were aligned by Mega7 software, following the ClustalW method. Phylogenetic tree was drawn according to the maximum likelihood method. Genetic distance was calculated by the K2P method. The maximum composite likelihood of the nucleotide substitution pattern was estimated using the substitution matrix. By using FFPred, InterProScan, TargetP, and Phyre2, secondary structures such as Alpha helix, Beta turn, and random coil, as well as the tertiary structure of the protein, were studied.Findings: According to the phylogenetic tree, the Lilium species were classified into 4 clusters: A, B, C, and D. The Iranian species was placed in cluster B. According to phylogenic topology as well as to the study of genetic distance, Lilium ledebourii had the highest similarities to L. pyrenaicum, L. ciliatum, and L. candidum with 97% bootstrap. In bioinformatic analysis, a high level of conservation was observed in the alignment of this protein. Lilium ledebourii contained arginine at position #271, which was similar only to L. pyrenaicum, L. ciliatum, and L. candidum. The other species had lysine at this position. The species displayed many differences in the positions of amino acids, such as at #317, #346, #363, and #417. The study of the similarities of the secondary structure of matk in L. ledebourii showed this protein to have 233 amino acids at α helix (45.51%), 24 amino acids at β turn (4.69%), and 156 amino acids at random coil (30.74%).Conclusions: The present study analyzed matk in Lilium ledebourii for the first time, revealing its secondary structure, the position of α helix and β turn. Additionally, the Tertiary structure of this protein was proposed for the first time. According to phylogenic topology as well as to the study of genetic distance, Lilium ledebourii had the highest similarities to L. pyrenaicum, L. ciliatum, and L. candidum. Overall, the molecular relationship (phylogenetics and protein structure) of Lilium ledebourii with other Lilium species was studied.