مطالعه تنوع dna کلروپلاستی و روابط ژنتیکی برخی ژنوتیپ‌های چای

سابقه و هدف: گیاه چای [camellia sinensis (l.) o.kuntze)] گیاهی نوشیدنی غیر الکلی با ویژگی‌های دارویی بسیاری است که در قرن گذشته وارد ایران شده و در منطقه شمال کشور کشت شده است. شناخت تنوع ژنتیکی موجود در گیاهان جهت برنامه‌های اصلاحی و حفاظت از ژرم‌پلاسم بسیار مهم است بطوری که می‌توان بیان کرد جمع آوری وارزیابی ذخایر ژرم پلاسم داخلی و خارجی، اساسی ترین مرحله دربرنامه‌های به‌نژادی گیاهان می باشد. مطالعات زیادی بر روی ژنوم هسته این گیاه صورت گرفته است اما بررسی روابط ژنوم اندامکی در این گیاه بسیار محدود می‌باشد. در این پژوهش برای اولین بار با استفاده از ژنوم کلروپلاست، تنوع بخشی از ژرم‌ پلاسم چای موجود در ایران مورد بررسی قرار گرفت.مواد و روش‌ها: در این تحقیق تعداد 35 نمونه گیاه چای از شش جمعیت (منطقه شرق چایکاری (نشتارود)، منطقه مرکز چایکاری (لاهیجان)، منطقه غرب چایکاری (فشالم)، ژنوتیپ‌های وارداتی از گرجستان، کلون‌های وارداتی از ژاپن و کلون‌های وارداتی از سریلانکا) موجود در سه کلکسیون پژوهشکده چای مورد بررسی قرار گرفتند. در ابتدا نمونه‌برداری از برگ‌های جوان و کاملاً توسعه یافته انجام و dna کل آنها استخراج شد. با استفاده از پنج جفت پرایمر عمومی کلروپلاست معرفی شده (dt، lf، hk، sc و rbcl) و چهار آنزیم برشی (bglii، hinfi، alui و psti) با کار برد روش واکنش زنجیره‌ای پلی مراز تفاوت طول قطعات حاصل از هضم (pcr- rflp) تنوع موجود در ژنوم کلروپلاست این گیاهان مورد بررسی قرار گرفتند. برنامه‌های ntsys و popgene برای آنالیز خوشه‌ای و جمعیتی داده‌ها، استفاده شدند.یافته‌ها: در این بررسی حدود bp6980 از ژنوم کلروپلاست گیاه چای در واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز تکثیر شده و با استفاده از آنزیم‌های برشی بررسی گشتند. از 20 ترکیب آغازگر /آنزیم ممکن، چهار ترکیب dt/ hinfi، dt/ alui، lf/ psti، hk/ hinfi حالت چند شکلی نشان داده و این چهار ترکیب نمونه‌ها را در هفت گروه هاپلوتایپی (h1، h2، h3، h4، h5، h6 و h7) قرار دادند. تمام این گروه‌بندی‌ها به دلیل رخ دادن جهش‌‌های حذف و اضافه در محدوده bp4010 ایجاد شده بود. حداکثر تنوع ژنتیکی (ht)، میانگین تنوع بین جمعیتی (hs) و تفاوت ژنتیکی بین جمعیت‌ها (gst) به ترتیب 0.46، 0.25 و 0.45 بدست آمد.نتیجه‌گیری: نتایج بررسی 35 نمونه‌چای نشان داد که هیچ گونه ساختار ژنتیکی مدونی مابین مناطق مختلف جمع آوری نمونه‌ها وجود ندارد؛ همچنین این نتایج تایید نمودند که امکان کاربرد روش واکنش زنجیره‌ای پلی مراز تفاوت طول قطعات حاصل از هضم (pcr- rflp) برای بررسی تنوع ژنتیکی و شناسایی ژنوتیپ‌های چای و ارقام آن وجود دارد.

Study of Chloroplast DNA diversity and Genetic Relationships of some Tea Genotypes

Background and objectives: The herbal tea [Camellia sinensis (L.) O.Kuntze)] is a nonalcoholic beverage with many medicinal properties that has entered Iran in the last century and cultivated in the northern region. Understanding the genetic diversity of plants for breeding programs and the protection of germplasm is very important so that it can be stated that the collection and evaluation of domestic and foreign germplasm reserves is the most important stage in plant breeding programs. Many studies have been done on the nucleus genome of this plant, but the investigation of the organelles genome relationships in this plant is very limited. For the first time in this research, we have tried to investigate the diversity of this germplasm in Iran by using the genome of chloroplasts.Materials and Methods: In this research, 35 teaplant samples from six populations (east tea cultivation district (Nashtarood), central tea cultivation district (Lahijan), west tea cultivation district (Fashalem), imported genotypes from Georgia, imported clones from Japan, and imported clones from Sri Lanka) in three collections of the tea institute were studied. At first sampling of young and fully developed leaves was performed and the DNA genomes were extracted. By using five pairs of specific primers for the chloroplast genome (DT, LF, HK, SC and rbcl) and four restriction enzymes (BglII, HinfI, AluI and PstI) with Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR RFLP) method, the variety in the chloroplast genome of these plants was investigated. NTSYS and POPGENE were used for cluster and population analysis.Results: In this study, about 6980bp of the tea chloroplast genome was amplified in polymerase chain reaction and examined by restriction enzymes. Of the 20 primer/ enzyme combinations, four combinations (DT/ HinfI, DT/ AluI, LF/ PstI and HK/ HinfI) were shown polymorphic pattern and these four compounds put samples into seven haplotypic groups (H1, H2, H3, H4, H5, H6 and H7). All these grouping were created due to the occurrence of insertiondeletion mutations in the range of 1040bp. Mean of genetic variation within (HS), Total (HT) and degree of genetic differentiations (GST) were 0.25, 0.46 and 0.45, respectively. Conclusion: The results of investigation of 35 tea samples showed that there was no cognitive genetic structure between the different sample regions. These results also confirmed the possibility of utilization Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR RFLP) technique to investigation of genetic diversity and identify genotypes and varieties of tea.