شناسایی و بررسی سیلیمارین قارچ اﻧﺪوﻓﻳﺖ ﺟﺪاﺳﺎزی شده از بذر گیاه خارمریم (silybum marianum (l) gaert.)

مقدمه: خارمریم (silybum marianum (l) gaert.) از خانواده آستراسه است و سیلیمارین به عنوان ماده موثره با ارزش این گیاه شناخته می‌شود؛ که در درمان تعدادی از بیماری‌ها، مانند بیماری‌های کبدی مورد استفاده قرار می‌گیرد. چالکون‌سنتاز یکی از آنزیم‌های کلیدی در تولید سیلیمارین می‌باشد. قارچ‌های اندوفیت بدون ایجاد بیماری، درون بافت گیاه زندگی کرده و تاثیر مفید بر مقدار تولید متابولیت‎های ثانویه گیاهان دارند. اخیرا چندین قارچ اندوفیت از گیاه خارمریم (silybum marianum (l) gaert.) جدا شده و مطالعه شیمیایی و مولکولی آنها مورد توجه قرار گرفته است. بنابراین این پژوهش با هدف جداسازی قارچ‎ اندوفیت از بذر گیاه خارمریم، بررسی و مقایسه سیلیمارین تولیدی قارچ‌ و گیاه، همچنین بررسی توالی‌های آمینواسیدی چالکون‌سنتاز مربوط به گیاه خارمریم (l silybum marianum.) و چند گونه قارچ دیگر از پایگاه اطلاعاتی ncbi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) انجام شد.مواد و روش‌ها: بدین منظور بذرهای خارمریم از محوطه دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری جمع‎آوری و پس از ضدعفونی در محیط ms کشت شدند. پس از ظهور قارچ در محیط، قارچ‌ها در شرایط استریل به محیط pda و به‌منظور خالص‌سازی، به محیط wa منتقل شدند. جدایه‌های رشد کرده به محیط pdb منتقل شده و پس از 10 روز استخراج سیلیمارین انجام شد. شناسایی مولکولی جدایه‌ قارچ اندوفیت با تکثیر نواحی ریبوزومی انجام شد، سپس همردیف‌سازی توالی بدست آمده با توالی‌های موجود در سایت ncbi با نرم افزار آنلاین blast مورد مقایسه قرار گرفتند و با رسم درخت فیلوژنی قارچ اندوفیت شناسایی شد. بررسی بیوانفورماتیکی چالکون‌سنتاز مربوط به گیاه خارمریم (l. silybum marianum) و چند گونه قارچ دیگر یا استفاده از پایگاه اطلاعاتی ncbi دامنه‎ها و موقعیت‎های مشابه چالکون‌سنتاز بدست آمد و با برنامه clustalo پایگاه اطلاعاتی uniprot بررسی شد. سپس با نرم‌افزارclc genomics workbench5.5.2 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و جدول مشخصات آنها رسم گردید. درخت فیلوژنی مربوط به این توالی‌ها با استفاده از نرم‌افزار mega7 و با روش neighbor joining رسم شد.یافته‌ها: نتایج بدست آمده با دستگاه کروماتوگرافی با کارایی بالا، تولید سیلیمارین از قارچ را نشان داد. مقدار سیلیمارین برای نمونه برگ تهیه شده از گیاه خودرو در محوطه دانشگاه، ppm 3/3079 و برای گیاه استریل درون شیشه ppm 1/7183 و برای قارچ اندوفیت ppm 0/729 اندازه‌گیری شد. شناسایی مولکولی جدایه‌های به‌دست آمده، با استفاده از نواحی its انجام و گونه آن،alternaria alternata شناسایی گردید. همچنین بررسی فیلوژنی چالکون‌سنتاز به عنوان آنزیم کلیدی برای تولید سیلیمارین بین این گیاه و چند قارچ صورت گرفت؛ که بیشترین نزدیکی را در گیاه s. marianum به قارچ alternaria sp نشان داد.نتیجه‌گیری: بررسی تولید سیلیمارین در قارچ جداسازی شده از بذرهای گیاه خارمریم، گیاه درون شیشه‌ای و فضای باز همراه با مطالعه بیوانفورماتیکی مسیر تولید آنزیم چالکون‌سنتاز، نقش موثر قارچ‌های اندوفیتی را در تولید سیلیمارین مشخص کرد. همچنین این جدایه قارچی قادر به تولید سیلیمارین در شرایط آزمایشگاهی بود.

identification and Comparison silymarin inendophytic fungi isolated from seed of Silybum marianum (L) Gaert.)

Introduction: Silybum marianum (L) Gaert.) Is a member of Asteraceae family, and silymarin is known as a valua effective substance in the plant, which is used to treat a number of diseases, such as liver disease. Chalcone synthase is one of the key enzymes in the production of silymarin. The fungal endophytes live in the tissues, without infection, and have a beneficial effect on the production of secondary metabolites of plants. Recently, several endophytic fungi from milk thistle (Silybum marianum (L) Gaert) have been isolated and studies were the chemical and molecular on its fungus has been considered. Therefore, this study aimed to isolate endophytic fungi from the seeds of milk thistle plant, and comparing the production of fungi and plant silymarin, as well as investigating the Chalcone synthase amino acid sequences associated with the L Silybum marianum and several other fungi from the NCBI database (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov).Materials and Methods: Therefore, this research was carried out to isolate endophytic fungi from the seeds of milk thistle plant, and to compare the production of fungal and plant silymarin. For this purpose, milk thistle seeds were collected from the area of Sari Agricultural and Natural Resources University and after disinfection, They sterilized in conditions, cultivated on MS medium. After appearance of fungi in the culture medium, the fungi were transferred to the PDA medium under sterile conditions the next for purification to WA medium. Fungal growth isolates were transferred to PDB medium and after 10 days of silymarin extraction Molecular identification of endophyte fungi isolates was performed by amplification of ribosomal areas, then the Alignment of the obtained sequence with the sequences on the NCBI site was compared with BLAST online software and identified with phylogeny tree of endophytic fungus. Investigate the bioinformatics of Chalcone synthase in L. Silybum marianum and several other fungi species,is use the NCBI database, was obtained by comparing domains and similar positions of Chalcone synthase, and was Investigating with the clustalo uniprot database. Then it was analyzed with CLC Genomics Workbench5.5.2 software and their specifications table was drawn up. The phylogeny tree of these sequences was drawn using the Mega7 software, using the Neighbor joiningResults: The results of high performance liquid chromatography confirmed the silymarin production of fungi. The amount of silymarin for leaf samples of intact plant was 33.079 ppm and for the in vitro grown plant was 17.183 ppm and for the endophyte fungus was 7. 29 ppm. Using ITS, molecular identification of isolates was carried out and its species was identified as Alternaria alternata. Also, analysis phylogenic relationship of chalcone synthase, as a key enzyme for production of silymarin, between milk thistle and a few fungi showed its closest proximity to to Alternaria sp.Conclusion: The study of the production of silymarin in fungi isolated from the seeds of milk thistle , in vitro and in vivo plants, along with the bioinformatics study of the pathway of production of Chalcone synthase enzyme, determined the role of endophytic fungi in the production of silymarin. The fungal isolate was also able to produce silymarin in laboratory conditions