بررسی تنوع ژنتیکی برخی ژنوتیپ‌های مرکبات ایران بر اساس خصوصیات مورفولوژی و نشانگرهای مولکولی issr و pcr-rflp

سابقه و هدف: ژرم‌پلاسم مرکبات ایران تنوع ژنتیکی گسترده‌ای دارد که ناشی از دگرگرده‌افشانی، سابقه طولانی ازدیاد بذری و فراوانی جهش‌های ژنتیکی است. برای تعیین وضعیت رده‌بندی، روابط فیلوژنتیک و فاصله ژنتیکی بین افراد این ذخیره ارزشمند ژنتیکی باید از ویژگی‌های مورفولوژی در کنار نشانگرهای مولکولی مبتنی بر dna استفاده کرد. در تحقیق حاضر برای کسب اطلاعاتی در مورد درجه قرابت ژنتیکی موجود بین 79 ژنوتیپ ناشناخته محلی مرکبات موجود در کلکسیون ایستگاه تحقیقاتی کترا و تعیین فاصله نسبی آنها از 18 رقم تجاری، سه نوع نشانگر (مورفولوژی، issr و pcr-rflp) مورد استفاده قرار گرفت.مواد و روش‌ها: مطالعه حاضر به صورت تحقیقی سه ساله و به منظور دستیابی به اطلاعات شناسنامه‌ای 79 ژنوتیپ محلی ناشناخته و 18 رقم تجاری مرکبات (شاهد)، تعیین روابط فیلوژنتیک و فاصله ژنتیکی آنها با یکدیگر انجام گرفت. این پژوهش بر اساس بررسی مقایسه‌ای تعداد 19 صفت رویشی و 40 صفت زایشی و تجزیه dna کلروپلاستی مبتنی بر نشانگرهای issr وpcr-rflp نمونه‌های برگی انجام گرفت. میانگین سه ساله صفات مورفولوژیک بر اساس استانداردهای توصیف‌نامه‌ای ثبت گردید. به منظور انجام مطالعات مولکولی، استخراج dna از نمونه‌های برگی هر ژنوتیپ انجام و مقدار dna با استفاده از نانودراپ در طول موج 260 نانومتر اندازه‌گیری شد. تجزیه خوشه‌ای داده‌های مورفولوژیک و مولکولی بر اساس داده‌های جفت نشده (upgma) و ضریب تشابه جاکارد صورت گرفت و اختلاف بین ژنوتیپ‌ها بر مبنای کدگذاری و رتبه‌بندی آنها صورت پذیرفت. یافته‌ها: نتایج حاصل از تجزیه خوشه‌ای داده‌های مورفولوژی و مولکولی با نرم‌افزارهای ntsys-pc و popgene نشان داد که کلیه ژنوتیپ‌ها می‌توانند بر اساس صفات ظاهری و نشانگرهای issr و pcrrflp به ترتیب در ضریب تشابه‌های 40%، 53% و 60% به 12، 9 و 5 خوشه اصلی طبقه‌بندی شوند. طبق داده‌های مورفولوژی، اولین خوشه (a) به دو زیرگروه تقسیم شد که یکی از آنها شامل 3 رقم لیمو بود. در خوشه دوم (b) همه ارقام پرتقال و نارنگی و در خوشه سوم (c) بالنگ، دارابی و گریپ‌فروت دانکن قرار داشتند. نتایج حاصل از تجزیه نشانگر issr نشان داد که درصد چند شکلی ژنوتیپ‌های بررسی شده از 92 درصد تا 53 درصد به ترتیب برای نشانگرهای n10 و n1 متغیر بود و تعداد قابل توجهی از آنها قرابت نزدیکی با پرتقال داشته‌اند. نتایج این مطالعه همچنین نشان داد که کامکوات بر اساس مشخصات مولکولی و صفات ظاهری جنسی متمایز از خانواده مرکبات است و می‌تواند در گروهی مجزا قرار بگیرد. از سوی دیگر، پرتقال‌ها، گریپ‌فروت‌ها و پوملوها همگی در یک گروه بودند و با این واقعیت که گریپ‌فروت‌ها دورگ‌هایی از پرتقال و پوملو هستند انطباق دارد. به این ترتیب، درجه مشابهت ژنوتیپ‌های ناشناخته محلی با یکدیگر و با رقم‌های شاهد تعیین شد. علاوه بر این، تمایز سه گونه c. reticulata، c. medica و c. maxima نیز به خوبی ممکن شد.نتیجه‌گیری:داده‌های حاصل از اندازه‌گیری صفات مورفولوژیک و مولکولی ژنوتیپ‌های ناشناخته مرکبات کلکسیون کترا می‌تواند اطلاعات شناسنامه‌ای هر ژنوتیپ ناشناخته محلی را مشخص و همچنین فاصله ژنتیکی و روابط فیلوژنتیک آنها را با یکدیگر و با رقم‌های تجاری تعیین کند. به این ترتیب، می‌توان در آینده بر اساس نتایج حاصله، گزینشی کارآمد از والدین تلاقی‌ها را برای دستیابی به اهداف برنامه‌های اصلاحی و ایجاد ارقام جدید ممکن کرد.

Investigation on genetic diversity of some unknown genotypes of citrus in Iran according to morphological and molecular characteristics based on ISSR and PCRRFLP markers

Background and objectives:Citrusgermplasm has an extensive diversity in Iran which is due to cross pollination, long history of seed propagation and abundance of genetic variations. For determining the classification status, the phylogenetic relationships and the genetic distance between members of this valuable genetic reserve, it is necessary to use of morphological characters along with DNAbased molecular markers. In the present study, to obtain information on the degree of genetic affinity between 79 unknown citrus biotypes in Kotra Citrus Research Station and determining their relative distance from 18 commercial cultivars, three types of markers (morphological, ISSR and PCRRFLP) were used.Material and methods: The present study was carried out asa threeyear research toobtain passport data for 79 biotypes and 18 commercial cultivars (check) of citrus trees, recognition of phylogenetic relationships and determination of genetic distance between these genotypes. This study was conducted on the basis of a comparative study of 19 vegetative and 40 reproductive traits and the analysis of chloroplast DNA based on ISSR and PCRRFLP markers of leaf samples.The threeyear average of morphological traits according to standard citrus descriptor were recorded.In order to perform molecular investigations, DNA extraction from the leaf samples of each genotype was performed and DNA was quantified using UVvisible spectrophotometer (nanodrop) at 260 nm. Cluster analysis of morphological and molecular data was performed based on the unpaid pairs (UPGMA) and Jaccard’s similarity coefficient anddifferences between genotypes were determined by coding and ranking of them. Results:Obtained results from cluster analysis of morphological and molecular data with NTSYSpc and POPGENE software, using the UPGMA method with Jaccard’s coefficient of similarity showed that all genotypes can be categorized according to morphological traits, ISSR and PCRRFLP markers into 12, 9 and 5 main groups respectively in the 40% , 53% and 60% similarity coefficient respectively. According to morphological traits, the first cluster (A) can be divided into two subgroups which there are three lemon varieties in one of them. Another group (B) contains all sweet orange and mandarin cultivars and the third group (C) was incorporates three genotypes including Citron, Pomelo and Duncan grapefruit.The use of ISSR marker showed that polymorphism of examined genotypes was varied from 92% to 53% for N10 and N1 markers, respectively and a significant number of them had close affinity to sweet orange.The results of this study also showed that kumquat, based on molecular characteristics and apparent traits, is a distinct genus of Citrus family and should be placed in separate group.On the other hand, sweet oranges, grapefruits and pomelos were all in the same group which is consistent with the fact that grapefruits are hybrids of sweet oranges and pomelo. In this way, the degree of similarity of the local unknown genotypes was determined to each other and to the commercial varieties (checksamples(.Also, the differentiation of three species (C. reticulata, C. medica and C. maxima) was possible.Conclusion:The data obtained from the measurement of morphological and molecular characteristics of unknown citrus genotypes could obtain a passport data for each biotypes and determine the phylogenetic relationships of biotypes with each other and with commercial cultivars. Obtained results could determine the genetic distance of biotypes from each other as well as from commercial varieties. In this way, in the future, parents can be efficiently chosen to perform corrective breeding programs for creating of new varieties.