کلونینگ و توالی یابی ژن p انسولین جدا شده از گیاه دارویی momordica charantia و تحلیل بیوانفورماتیکی ساختار سه بعدی پروتئین

سابقه و هدف: کارال با نام علمی charantia momordica از خانواده cucurbitaceae می باشد. بذرهای کارلا دارای پلی پپتیدی به نام pانسولین می باشد که از 172 اسید آمینه تشکیل یافته است. مقدار pانسولین بسته به بافت گیاه، رقم، محل کشت و فصل برداشت بسیار متغیر است و در مجموع مقدار آن نسبتا پایین میباشد بطوریکه این میزان برای تولید صنعتی داروها بر پایه این ترکیب کافی نیست. علاوه بر این به دلیل وجود ترکیبات مداخله گر مانند پلی ساکارید ها، ممکن است این ماده موثره تاثیر کمتری داشته باشد. کلون کردن ژن p انسولین و بیان هترولوگ آن در میکروارگانیسم ها، راه حلی سریع و مفید برای حل این مشکل است. بدین منظور در این تحقیق توالی ژن p انسولین از گیاه کارلا از طریق rtpcr شناسایی و سپس توالی یابی شد.مواد و روش ها: به منظوراستخراج rna ، در دو مرحله نارس و رسیده از فرابر، آریل بذر و بذر گیاه کارلا نمونه گیری انجام شد. کمیت و کیفیت rna استخراج شده از طریق دستگاه اسپکتروفوتومتری و الکتروفوز بر روی ژل tbe 1% تعیین شد. سپس جهت کلونینگ ژن pانسولین، rt-pcr با پرایمرهای اختصاصی ژن pانسولین انجام شد. سپس محصول rt-pcr ژن pانسولین ، از طریق ژل الکتروفورز خالص سازی و کلونینگ ژن pانسولین در تی وکتور صورت گرفت. پس از استخراج پلاسمید نوترکیب و تایید حضور ژن pانسولین در تی وکتور، پلاسمید نوترکیب تعیین توالی شد. در ادامه ساختار سه بعدی پروتئین pانسولین از طریق مدلینگ به کمک نرم افزار phyre 2.0 (www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) بررسی شد.یافته ها:در نتایج بدست آمده ازالکتروفورز rna از بافت های مختلف کارلا، وجود دو باند مربوط به 28srrna و 18srrna نشان دهنده استخراج موفق rna بود. نتایج rt-pcr با پرایمرهای اختصاصی ژن pانسولین باند اختصاصی bp750 موید تکثیر صحیح cdna بود. همچنین، بیان ژن pانسولین در بافت آریل بذر رسیده بیشتر از سایر بافت های میوه بود. پس از خالص سازی باند مربوط به ژن pانسولین ، واکنش لیگاسیون ژن هدف در داخل تی وکتور و ترانسفورماسیون آن به داخل میزبان e. coli صورت گرفت که نتایج مثبت موید انجام موفق کلونینگ بود. در ادامه تعیین توالی ژن pانسولین، از گیاه دارویی کارلا برای اولین بار در ایران انجام شد. نتایج بیوانفوماتیک نشان داد که دومین های فعال منواکسیژناز متصل شونده به fda در بخش n ترمینال و پرولیپوپروتئین دی آسیل گلیسریل ترانسفراز در c ترمینال پروتئین p انسولین وجود دارد. نتیجه گیری:بیان کم پروتئین p انسولین در گیاه کارلا و وجود ترکیبات مداخله کننده مانند پلی ساکاریدها ممکن است باعث کاهش تاثیر ماده موثره کاهنده قند خون می شود. لذا، در این تحقیق ژن p انسولین از گیاه کارلا کلون و تعیین توالی شد. تعیین توالی ژن p انسولین امکان بیان هترولوگ آن در میکروارگانیسم و تولید فراوان و خالص پروتئین p انسولین را به عنوان دارو فراهم خواهد کرد.-

Cloning and sequencing of p insulin gene isolated from Momordica charantia and in silico analysis of three dimension of protein structure

Abstract:Background and objectives:Diabetes is a disease that the body loses its ability to control blood sugar also it is directly associated with an increased risk of cardiovascular disease. Synthetic hypoglycemic drugs can cause serious side effects. Herbal drugs have potential therapeutic applications because they are effective, have fewer side effects and are of relatively low cost. The Momordica charantia (Linn Family: Cucurbitaceae), whose fruit is known as Karela or bittergourd. Karela is one of the famous vegetables of South Asia, India and is grown in the Amazon, East Africa, Islands in the Caribbean and South America to provide food and medicine.An antidiabetic agent PolypeptideP, a 172 amino acid polypeptide isolated from MC seeds. The content of PolypeptideP in cultivated plants is relatively low and varies widely with tissue, variety, origin and harvest season. Due to impurities such as polysaccharides, the effective ingredient will be less. Gene cloning and expression of this polypeptide in microorganism is a quick and useful alternative for solving such problems. Therefore, in this study the sequence of pinsulin gene from Karela was detected by RTPCR then sequenced.Material and method:RNA was sampled on ripen and unripen fruit from pericarp, seed aril, and seed. Quantification and qualification of extracted RNA was done by spectrophotometer and electrophoreses respectively. Then the RTPCR reaction was done by pinsulin specific primers and purified by gel electrophoresis and cloned in Tvector plasmid. The recombinant plasmid was extracted and verified to carry pinsulin gene. Then, the recombinant plasmid was done to sequence the pinsulin gene. The 3D structure of pinsulin protein was evaluated by Phyre 2.0 (www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) software.Results:The electrophoresis of extracted RNA from Karela tissues showed the two 18SrRNA and 28SrRNA bands. A 750 base pair RTPCR product was amplified by pinsulin specific primers. Also, the RTPCR result depicted that the pinsulin gene was expressed in aril tissue more than other parts of the fruit. The result showed that the cloning process of pinsulin gene consist of purification of pinsulin PCR production, the ligation reaction and transformation of it’s into the E. coli was successful. Then, the Karela isolated pinsulin gene was sequenced for the first time in Iran. Blasting the plant insulin protein sequence in uniprot database (www.uniprot.org) detected the most important candidate domains including FDAbinding monooxygenase at the N terminal and Prolipoproteindiacyl glyceryltransferase at C terminal of protein. Conclusion: The low expression of pinsulin and the presence of polysaccharide impurities in Karela reduces the effect of a blood glucoselowering agent. Therefore, in this study, pinsulin gene of Karela was isolated and sequenced. The sequencing of pinsulin gene will allow its heterologous expression in microorganisms and pure production of pinsulin protein.Key words: Momordica charantia, Diabetes, Cloning, Sequencing, Bioinformatics