استفاده از سیستم crispr/cas9 برای دستکاری ژن sgr فستوکای بلند بر اساس بیان موقت

سابقه و هدف: یکی از فناوری های پیشرفته در ویرایش ژنوم، مربوط به فناوری تکرارهای کوتاه پالیندرومی فاصله دار منظم خوشه ای است. در این پژوهش rna راهنمای مربوط به ژن sgr درگیر در تجزیه کلروفیل، در تماس نزدیک با پروتئین cas9 در سازه crispr برای هدف قرار دهی این ژن در برگ های فستوکای بلند قرار گرفت. مواد و روش‌ها: در راستای ساخت سازه crispr/cas9 قابل برنامه ریزی برای هدف گیری ژن sgr، ابتدا یک توالی 20 نوکلئوتیدی روی اگزون ژن sgr فستوکای بلند انتخاب گردید. این توالی ابتدا در سازه penchimera جاسازی و سپس به وسیله فناوری gateway به حامل بیان منتقل گردید. حامل مد نظر پس از تایید به وسیله واکنش زنجیرهای پلی مراز و توالی یابی، به agrobacterium tumefaciens برای آزمایش های بیان موقت منتقل گردید. در گام دوم سازهcrispr و سازه تشدید بیان (pb2wg7) دارای ناحیه رمز کننده ژن sgr به طور همزمان به برگ های توتون به وسیله روش agroinfiltration‌ منتقل گردید. ناحیه آلوده شده پس از استخراج dna توالی یابی شد. در آزمایشی دیگر سازه crispr طراحی شده به طور مستقیم و به صورت موقت در برگ های بالغ جوان فستوکای بلند تحت تنش، بیان گردید.یافته‌ها: واکنش زنجیره ای پلی مراز و توالی یابی، جایگیری درست rna راهنما را در دو حامل به کار رفته در این آزمایش تایید مینماید. بیان موقت همزمان دو سازه در برگ های توتون که با استفاده از استخراج dna و توالی یابی از محل آلوده ارزیابی شد، نشان می‌دهد که با وجود قرار گیری درست توالی در این سازه در عمل قادر به برش ژن sgr فستوکای بلند بیان شده در گیاه توتون نمی باشد. ولی در آزمایش دوم بیان موقت سازه crispr/cas9 در برگ های فستوکای بلند دارای ژن طبیعی sgr بیانگر این است که این سازه به شکل جالبی قادر به توقف بیان ژن sgr و در نتیجه توقف تجزیه کلروفیل برگهای فستوکای بلند در مقایسه با شاهد می‌باشد. نتیجه‌گیری: استفاده از فناوری gateway به میزان چشمگیری در مقایسه با روش آنزیم های برشی سرعت و دقت در ساخت سازه نهایی crispr/cas9 را بالا برد. فناوری crispr/cas9 زمانی که روی برگ های توتون برای هدف قرار دهی ژن sgr فستوکای بلند استفاده شد موفقیت آمیز نبود که به احتمال به دلیل بیان غیر هدفمند در موجودی است که ژن sgr به طور طبیعی در آن وجود ندارد ولی زمانی که سازه به صورت موقت در برگ های دارای ژن اصلی sgr (فستوکای بلند) بیان شد نتایج مشاهده شده به طور آشکاری بیانگر این بود که ژن sgr فستوکای بلند به وسیله crispr‌ غیر فعال گردیده و در نتیجه آن در شرایط تنش برگ های فستوکای بلند سبزتر باقی ماندند.

Transient expression-based CRISPR/Cas9 system for manipulation of tall fescue SGR gene

AbstractBackground and ObjectivesA clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) is one of the precise genome editing techniques. In present experiment guide RNA associated to the tall fescue SGR gene (FaSGR) joint to the Cas9 protein in CRISPR system so as to target SGR in tall fescue ((Festuca arundinacea ’Jaguar ′) leaves.Materials and methodsIn order to construct programmable CRISPR/Cas9 system for targeting FaSGR, 20 nucleotides of exon originated FaSGR gene were selected. This 20 bp firstly integrated into pEn/Chimera vector followed by LR reaction (gateway system) in which aforementioned segment transferred into the ccdB frame of expression vector. Sequenced and PCR certified vector by gene specific primers (GSPs) then inserted to the GV 3101 strain of Agrobacterium tumefaciens. For construction of overexpression vector (OE) of SGR gene, full length of FaSGR was isolated from tall fescue leaf through gene specific primers and after cloning in EColi integrated into pB2WG7 vector using Gateway technology. In second step CRISPR construct and overexpression pB2WG7 vector harboring full length of FaSGR, cotransformed into tobacco leaves through agroinfiltration method. DNA extracted from agroinfected area and sequenced by gene specific primers. In other experiment CRISPR /Cas9 construct transiently and directly expressed in young mature tall fescue leaves subjected to abiotic stress.Results:Polymerase chain reaction and DNA sequencing strongly support guide RNA order in two vectors. Transient coexpression of two separate vectors in tobacco leaves after receiving DNA extraction and sequencing data, vividly showed, although the segment sequence and order of guide RNA is fine but no deletion in FaSGR gene was observed by applying CRISPR/Cas9 system. However in second experiment transient expression of CRISPR/CAS9 in tall fescue leaves which having natural FaSGR gene under vacuum pressure surprisingly suppress SGR expression whereupon improve tall fescue leaf color quality compared to control leaves. Conclusion:Gateway technology which has been used in this experiment greatly improved preciseness of CRISPER/Cas9 construct design and shorten times in contrast to that of restriction enzymes method. On model plant tobacco CRISPR/Cas9 was not successful in order to cut FaSGR gene on target site. This likely can be due either to the heterologous expression of this gene in untargeted organisms or different promoter governs genes. However, when we applied this transient expressionbased genome editing system on tall fescue leaves under vacuum, we clearly observed FaSGR inactivated by CRISPR/Cas9, as a result tall fescue leaves stayed much greener under salt and heat stress than control.