استفاده از TAIL-PCR در شناسایی و تکثیر توالی های نوکلئوتیدی مجاورT-DNA در ژنوم آرابیدوپسیس (Arabidopsis thaliana)

دراین تحقیق از tail-pcr که در آن از دمای اتصال آغاز گر به صورت نامتقارن استفاده می شود جهت تشخیص توالی های نوکلئوتیدی درون و مشرف به t-dna وارد شده به ژنوم گیاه آرابیدوپسیس استفاده شده است. در این روش توالی های نوکلئوتیدی مرزهای چپ و راست یک t-dna به عنوان موقعیت نشاندار شده قملداد گردیده و از دو نوع آغازگر که از نظر طول و دمای اتصال با هم متفاوتند استفاده گردید تا توالی های مورد هدف تکثیر شوند. نوع اول آغازگرهای اختصاصی با طول بلند و دمای اتصال بالا و با سه توالی متفاوت ولی آشیانه ای است که متناظر با توالی های شناخته شده مرزهای چپ و راست t-dna است و نوع دوم آغازگرهای اختیاری با طول کوتاه و دمای اتصال پایئن تر بودند. چهار موتانت گیاه آرابیدوپسیس که در اثر وارد شدن t-dnaبه ژنومشان به یونیکانازول (ماده ای که از تولید جیبرلین اسید جلوگیری کرده و می تواند به عنوان علف کش استفاده شود) مقاومت نشان داده بودند در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند. اجرای tail-pcr در سه مرحله صورت گرفت که در مرحله دوم و سوم به ترتیب از فرآورده های رقیق شده مراحل اول و دوم به عنوان dna نمونه یا template استفاده گردید. درهر چهار موتانت مورد نظر به کار گرفته می شد به طوری که در هر بار اجرای pcr چهل مخلوط واکنش متفاوت هم زمان تهیه و اجرا می گردید.با مطالعه فراورده های مراحل دوم وسوم tail-pcr روی ژل آگارز دو درصد و مقایسه باندهای مربوط به هر موتانت درهر مرحله، فراورده های اختصاصی از غیر اختصاصی تفکیک شده و با انتخاب باندهای با اندازه مناسب و استفاده از کیتهای خالص سازی dna، نمونه های منتخب خالص سازی شده و توالی یابی شدند. همخوانی توالی های نوکلئوتیدی حاصل، با مرزهای چپ و راست t-dna حاکی است که روش مورد استفاده با دقت کافی موقعیت های نشان دار شده روی ژنوم گیاه را هدف قرار داده و از این جهت روش مطلوبی در تکثیر توالی های نوکلئوتیدی مشرف به t-dna قلمداد گردید.