دستکاری ژنتیکی سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی مشتق از چربی با mir-34a

سابقه و هدف: ژن تراپی ایمن و موثر به عنوان یکی از اهداف درمانی در بسیاری از بیماری ها در نظر گرفته می شود. با توجه به نقش مهم سلول های بنیادی در سل تراپی، این مطالعه با هدف تولید سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی انسان (hasc) با افزایش بیان mir34a انجام شد. روش بررسی: توالی پیش ساز hsamir34a در وکتورpcdh لنتی ویروس کلون شد. وکتور نوترکیب و دو وکتور کمکی یعنی pspax و pmd2 با روش کلسیم فسفات به داخل hek293t منتقل شدند. سوپ ویروسی جمع آوری و با اولترا سانتریفیوژ تغلیظ شد. سلول هایhek293t ترانسدیوس شده در روز چهارم با فلوسایتومتری ارزیابی شدند. پس از تعیین غلظت ویروسی، سلول های hasc با ویروس های تغلیظ شده ترانسدیوس شدند. استخراج rna و سنتز cdna به منظور ارزیابی میزان بیان mir34a با real time pcr انجام شد. یافته ها: توالی پیش ساز hsamir34a کلون شده در وکتور pcdh با colonypcr و dna sequencing تائید شد. ترانسداکشن سلول های hek293t و hasc در زیر میکروسکوپ معکوس فلورسنت دار و فلوسایتومتری مورد تائید قرار گرفتند. ارزیابی میزان بیان mir34a در سلول های آلوده به ویروس نوترکیب نشان داد که نسبت بیان mir34a در گروه تست به طور معنی داری بیشتر از گروه کنترل بود (0.001=p). نتیجه گیری: این مطالعه نشان دادکه از سیستم های لنتی ویروس ها می توان برای وارد کردن ژن های خارجی نظیر mir34a به سلول ها استفاده کرد. همچنین این مطالعه نشان داد که سلول های بنیادی دستکاری شده ژنتیکی به عنوان delivery system برای انتقال mir34a و یا هر ژن دیگری می توانند استفاده شوند.

Gene manipulation of human adipose-derived mesenchymal stem cells by miR-34a

Background: Safe and effective gene therapy is considered as one of the therapeutic goals in many diseases. Due to the important role of stem cells in cell therapy, this study aimed to produce human adiposederived mesenchymal stem cells (hASCs) using the miR34a overexpression.Materials and methods: The hsamir34a precursor sequence was cloned into the PCDH lentiviral vector. The recombinant vector and two helper vectors, i.e. psPAX and pMD2, were transferred into HEK293T cell line by calcium phosphate method. Viral supernatant was collected and concentrated by ultracentrifuge. On the fourth day, transduced HEK293 T cells were analyzed by flowcytometry. After the determination of viral concentration, hASC cells were transduced with condensed viruses. RNA extraction and cDNA synthesis were performed in order to assess miR34a expression level by Real Time PCR.Results: The hsamir34a precursor sequence cloned into PCDH vector was confirmed by colonyPCR and DNA sequencing. Transduction of HEK293T cells and hASCs were confirmed under fluorescent inverted microscope and flowcytometry. The assessment of miR34a expression level in infected cells with recombinant virus showed that the expression ratio of miR34a in the test group was significantly higher than the control group (P=0.001).Conclusion: This study showed that lentiviral systems can be used to insert actopic genes like miR34a into cells. It also showed that genetically manipulated stem cells can be used as a delivery system to deliver miR34a or other genes.