بررسی و مقایسه روش‌های مبتنی بر رسوب دهی و کروماتوگرافی تمایلی در تخلیص پروتئین نوترکیب استرپتوکیناز

سابقه و هدف: تخلیص پروتئین با بازده و خلوص بالا چالشی جدی در تهیه پروتئین های نوترکیب دارویی است. از بین استراتژی های تخلیص پروتئین هدف، روش های تخلیص بر پایه کروماتوگرافی تمایلی مانند ni-nta بسیار پرکاربرد و در عین حال هزینه بر هستند. روش های تخلیص مستقل از ستون، مانند استفاده از پروتئین های شبیه به الاستین (elp)، به عنوان روش های جایگزین در حال توسعه هستند. در این تحقیق، کارایی استفاده از رزین نیکل، elp و ترکیب آنها (elp/ni-nta) در تخلیص پروتئین استرپتوکیناز مورد ارزیابی قرار گرفت. روش بررسی: ژن استرپتوکیناز توسط pcr تکثیر، در پلازمیدpet21 کلون و به سلولe.coli-rosetta ترانسفرم شد. پروتئین آن بیان و تخلیص شد سپس ماهیت و خلوص پروتئین به ترتیب توسط وسترن بلات و sds-page مورد ارزیابی قرار گرفت. بازده خالص سازی در هریک از روش های تخلیص با میکروبرادفورد محاسبه شد. یافته ها: بازده خالص سازی elp-sk-his با استفاده از ستون ni-nta به مقدار µg/ml 14±108 و elp به مقدار µg/ml 16±76 و elp/ni-nta به مقدار µg/ml 11±88 محاسبه شد. نتایج رنگ آمیزی و وسترن بلات نشان داد که کیفیت خلوص پروتئین خالص شده با elp/ni-nta بیشر از روش elp و ni-nta به تنهایی بود.نتیجه گیری: مطالعه حاضر نشان داد که ادغام روش های خالص سازی در یک مرحله می تواند باعث افزایش خلوص و بازده محصول نهایی در تولید پروتئین های نوترکیب دارویی شود.

Evaluation and comparison of affinity chromatography and precipitation– based methods on purification of recombinant streptokinase

Background: Increase of protein purity is a serious challenge in the production of recombinant therapeutic proteins. For this purpose, several strategies have been employed to purify the target protein, among which the affinity chromatographybased purification methods and tagged proteins such as NiNTA are common and but costly. Therefore columnfree purification techniques, such as using elastinlike proteins (ELPs), are being developed as alternative method. In present study, the efficacy of NiNTA, ELP, and the combined NiNTA/ELP was evaluated for purification of streptokinase as a model protein at lab scale.Materials and methods: Streptokinase gene was amplified by PCR, cloned into pET21ELP, and transformed into E.coli BL21 Rosetta cell. The expressed protein was then purified using the methods described above. The identity and purity of the protein were evaluated by western blot using AntiHis antibody and SDSPAGE, respectively. The purification yield was also calculated for each method by microBradford assay.Results: The purification yield was calculated as 76 ± 16 μg/ml in ELP precipitation, 108 ± 14 μg/ml in NiNTA purification and 88 ± 11 μg/ml in NiNTA/ELP combined method, respectively. The SDSPAGE results showed that the purity of streptokinase purified by the combined method was higher than that of each method separately.Conclusion: The present study showed that the integration of purification methods in one step can increase the purity and yield in purification process of recombinant therapeutic proteins.