تاثیر چندگونه مخمر بر کاهش آفلاتوکسینB1 آسپرژیلوس فلاووس در مدل شبیه‌سازی شده معده انسان

آفلاتوکسین b1 یکی از متابولیت‌های ثانویه گونه‌های خاصی از قارچ آسپرژیلوس است که بسیار سرطان‌زاست. اﺧﯿﺮاً استفاده از میکروارگانیسم ها جهت کاهش جذب مایکوتوکسینی ها در دستگاه گوارش افزایش یافته است؛ لذا در این پژوهش اثر سه گونه مخمر ساکارومایسس سرویزیه، پیچیا فرمنتانس و رودوتورولا موسیلاژینوزا بر کاهش آفلاتوکسین b1 در محیط شبیه‌سازی شده معده مورد بررسی قرار گرفت. ابتدا قارچ آسپرژیلوس فلاووس از دانه ذرت جداسازی و خالص‌سازی شد. سپس تولید توکسین در محیط کشت pdb زیر نور uv با تابش فلورسانس آبی تایید شد. توکسین به روش حلالیت در کلروفرم استخراج و تزریق گردید و غلظت آن توسط دستگاه hplc، ng/ml 0.49 تعیین شد. محیط معده به غلظت های تهیه شده از سم 0.1 میلی‌لیتر از آفلاتوکسین b1 در غلظتیهای 0.25 و 0.5 نانوگرم در میلی‌لیتر و همچنین غلظت 0.49 نانوگرم در میلی‌لیتر سم استخراجی از جدایه آلوده گردید و سپس مخمرها اضافه و انکوباسیون شدند. سپس در زمانیهای صفر و 120 دقیقه سانتریفوژ شده و سوپرناتانت به‌دست آمده برای تعیین غلظت توکسین باقی‌مانده توسط روش الایزای رقابتی مستقیم بررسی گردید. آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با آزمایش فاکتوریل انجام شد. فاکتور اول گونه مخمر(چهار سطح: سه مخمر و تیمار بدون مخمر)، فاکتور دوم غلظت (چهار سطح: صفر، 0.25، 0.50 و 0.49 نانوگرم بر میلی‌لیتر) و فاکتور سوم زمان (شامل دو سطح: صفر و 120 برای معده) بود. این آزمایش در سه تکرار انجام شد. نتایج نشان داد هر سه مخمر نسبت به شاهد (بدون مخمر) در کاهش غلظت توکسین در معده توانایی داشتند اما تاثیر رودوترولا موسیلاژینوزا بیشتر از سایرین بود. کمترین غلظت سم در سوپرناتانت در غلظت ng/ml 25/ نانوگرم در میلی‌لیتر مشاهده شد. همچنین با گذشت زمان غلظت توکسین در سوپرناتانت کاهش یافت. اثر متقابل گونه مخمر و غلظت توکسین نشان داد نسبت به شاهد در هر سه غلظت هر سه مخمر توانایی کاهش غلظت توکسین را داشتند. حداقل غلظت توکسین در سوپرناتانت معده در غلظت ng/ml 0.25و گونه رودوترولا موسیلاژینوزا به‌دست آمد. نتایج اثر متقابل گونه مخمر و زمان نشان داد در هر دو زمان، هر سه مخمر توانایی کاهش غلظت توکسین در سوپرناتانت را داشتند و حداقل غلظت توکسین در سوپرناتانت در زمان 120 دقیقه و برای گونه رودوترولا موسیلاژینوزا مشاهده شد. نتایج اثر متقابل زمان و غلظت نشان داد در غلظت ng/ml 0.25 غلظت توکسین در سوپرناتانت در 120 دقیقه در کمترین حد خود بود. نتایج اثر متقابل گونه مخمر، زمان و غلظت توکسین مشخص کرد کمترین غلظت توکسین در سوپرناتانت مربوط به تیمار مخمر رودوترولا موسیلاژینوزا در زمان 120 دقیقه و غلظت ng/ml 0.25 بود. در مجموع، نتایج به‌دست آمده در تحقیق حاضر نشان داد هر سه گونه مخمر توانایی کاهش آفلاتوکسین b1 را در محیط معده داشتند اما مخمر رودوترولا موسیلاژینوزا را می‌توان به‌عنوان موثرترین (کارآمدترین) جدایه در بیوکنترل آفلاتوکسین b1 معرفی نمود.

The effect of some species of yeasts on reduction of aflatoxin B1 of Aspergillus flavus in simulated model of human stomach

Introduction: AFB1 is a highly carcinogenic secondary metabolite of some species of Aspergillus. Recently, use of microorganisms has been increased to reduce the absorption of mycotoxins in gastrointestinal tract. So, in this study the effect of the three yeasts Saccharomyces cerevisiae, Pichia fermentans, and Rhodotorula mucilaginosa on reduction of AFB1 in a simulated model of human stomach was investigated.; ;Materials and methods: At first, A. flavus was isolated and then were purified. Then, AFB1 was produced in PDB media and presence of AFB1 was determined by blue fluorescence radiation under UV light. Toxin was extracted using the method of solvation in chloroform and injected into HPLC and the final concentration was 49 ng/ml. The simulated stomach was contaminated with 0.1 ml samples of AFB1 of three concentrations: 0.25 ng/ml and 0.50 ng/ml from standard AFB1 and also 49 ng/ml from the A. flavus under study. Then the yeasts were added and the mixture was incubated. After sampling at 0 and 120 minutes, the samples were centrifuged. The supernatants were separated to determine the concentration of residual toxin by direct competitive ELISA method. The experiment was conducted in a completely randomized design with a factorial experiment. The three factors included yeast (four levels: three yeasts and nonyeast treatments), concentration (four levels: 0, 0.25, 0.50 and 0.49 ng/ml) and time (two levels: 0 and 120 min). The whole experiment was carried out 3 times.; ;Results & ddiscussion: The results showed that all three yeasts had the ability to reduce the toxin in the stomach compared to the control treatment (without yeast), but the effect of R.mucilaginosa was more significant than the other two. The lowest toxin concentration in supernatant was observed at 0.25 ng/ml. Over time, toxin concentration in supernatant decreased. The interaction of yeasts and toxin concentration showed that in comparison with the control, at each three concentrations, all three yeasts could reduce toxin concentration. The minimum toxin concentration in supernatant was obtained at 0.25 ng/ml in the presence of R.mucilaginosa. The results of interaction of yeast×time showed that after both 0 and 120 minutes, all three yeasts were able to reduce the toxin and the minimum toxin concentration was observed after 120 minutes for R.mucilaginosa. The results of interaction of time and toxin concentration in the model showed that at 0.25 ng/ml toxin concentration was at the lowest level after 120 minutes. The results of interaction of yeast×time×toxin concentration showed that the lowest toxin concentration was related to R.mucilaginosa after 120 minutes at 0.25 ng/ml. To conclude, the results of this study showed that all three yeasts had the ability to reduce AFB1 in the simulated model of human stomach, but R.mucilaginosa can be introduced as the most efficient isolate in biocontrol of AFB1.