اثر انجماد شیشه ای تخمک های نابالغ گوسفند بر بیان ژن hsp70 در تخمک و بلاستوسیست های حاصله

انجماد شیشه ای سبب حذف بسیاری از مشکلات مربوط به انجماد تخمک و جنین شده است.  از سویی برخی مشکلات در رابطه با تولید جنین در شرایط آزمایشگاهی ممکن است هر گونه تغییر در رونویسی ژنوم جنین را نشان دهد.  هدف از این مطالعه بررسی تاثیر انجماد بر بیان ژن hps70 (از ژن های مربوط به استرس های محیطی) در جنین گوسفند است.  تعداد 120 مجموعه تخمک کومولوس گوسفند در مرحله ی وزیکول زایا از تخمدان گوسفندان کشتارگاهی بازیابی شد.  مجموعه ی تخمک کومولوس به منظور انجماد وارد محلول پایه ی htcm (با 20 درصد fbs) قرار گرفته و بلافاصله روی کرایوتاپ منتقل شده و در نیتروژن مایع قرار گرفتند.  بعد از 48 ساعت از آغاز انجماد، تخمک ها به ترتیب در محلول هایw1 ، w2  و w3 (هر یک به مدت 5 دقیقه) گرمسازی شدند.  w1 شامل محلول پایه و 1 مول سوکرز، w2: شامل محلول پایه و 0.5 مول سوکرز و w3 محلول پایه و 0.25 مول سوکرز بود.  مجموعه ی تخمک کومولوس شیشه ای و گرم شده (60 عدد، گروه تیمار) و مجموعه تخمک کومولوس تازه (60 عدد، گروه کنترل) طبق روال عادی آزمایشگاهی با پایه ی sof وارد فرایند ivm، ivf و ivc شدند.  سپس مراحل رشد تخمک و همچنین میزان بیان ژن hsp70 نسبت به ژن β اکتین (به عنوان کنترل داخلی) بین بلاستوسیت و اووسیت قبل و بعد از انجماد مقایسه شد.  بر اساس نتایج حاصل از این مطالعه انجماد شیشه‌ای بر روی جنین در مراحل مختلف تکوین تاثیر معنی دار داشت و باعث کاهش میزان تکوین شد.  همچنین میزان زنده‌مانی در گروه منجمد شیشه‌ای کاهش یافت و این نکته موید آن است که انجماد تاثیرات منفی بر زنده مانی و میزان تکوین دارد.  در مطالعه ی حاضر با در نظر گرفتن دو گروه تخمک های تازه و منجمد، میزان بیان ژن hsp70 تغییر معنی دار نشان داد ولی این اختلاف ناشی از تاثیر شیشه‌ای سازی نبود.  مرحله ی تکاملی جنین اثر معنی داری بر بیان ژن hsp70 داشت ولی میزان بیان در مراحل مختلف تکامل جنینی تحت تاثیر شیشه‌ای شدن تخمک قرار نگرفت.

Effect of vitrification of ovine immature oocytes on subsequent oocyte and blastocyct HSP70 gene expression

Vitrification removed many of the problems related to cryopreservation of oocytes and embryos. On the hand, some problems related to in vitro produced embryos may indicate any alteration in embryonic genome transcription. The present study aimed to investigate whether oocyte vitrification may alter expression of a gene that can change following environmental stress, i. e., HSP70 or not. Total of 120 immature germinal vesicle stage ovine cumulus oocyte complexes (COC) were retrieved from abattoir collected ovine ovaries. The COCs were subjected to vitrification in HTCM based (with 20% FBS) media as V1: DMSO (10 %), Ethylene glycol (10 %) for 30 min, V2: DMSO (10 %), Ethylene glycol (10 %) and 0.5 M sucrose immediately left on the cryotop device and immersed within liquid nitrogen. At least after 48 hrs of vitrification, the oocytes were warmed in warming solutions as W1: basic medium with 1 M sucrose, W2: basic medium and 0.5 M sucrose and W3 basic medium and 0.25 M sucrose, each of them for 5 min. The vitrifiedwarmed COCs (n=60) and fresh COCs (n=60) were subjected to routine IVM, IVF and IVC procedures of the laboratory with SOF based media. The developmental stages of oocytes were compared and the expression rate of HSP70 to an average of βactin and B2m genes expressions were compared between blastocysts and oocytes before and after vitrification. The results of the study showed the impact of vitrification of germinal vesicle stage oocytes on the next developmental competence of the respected embryos in all stages. The expression of HSP70 was significantly different between oocytes and blastocysts; however the vitrification of immature ovine oocytes did not affect the expression rate of HSP70 in oocytes the respective blastocysts. In conclusion, vitrification does not affect  the vitrified ovine immature oocytes and the next developed blastocysts.